孙伟，蔡静，叶润*，赵丽平，王欣
(信阳农林学院生物与制药工程学院，河南信阳 464000)
摘要
为确定从花椒叶中提取多糖的最佳工艺条件及其抑菌活性，以花椒叶为原料、蒸馏水为浸提剂，采用超声波辅助提取花椒叶多糖。在单因素实验的基础上，选定料液比为1∶20 g/mL，并进一步选取超声温度、超声时间、醇沉浓度为考察因素，以花椒叶多糖提取率为响应值，应用Box-Behnken试验进行3因素3水平设计，采用响应面法来优化花椒叶多糖的提取工艺，并用牛津杯法对其抑菌作用进行测定。结果显示：料液比1∶20 mL/mg、超声时间38 min、超声温度69 ℃、醇沉浓度为90%条件下，花椒叶多糖提取率最高，实际测得值为0.981%，与理论值0.990%接近。抑菌实验结果显示，花椒叶多糖对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均有明显的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用更为明显。说明该工艺参数切实可行，且提取得到的花椒叶多糖具有一定的抑菌作用。
引言 结论 为了最大程度的提高花椒叶多糖的提取率，本实验通过水提醇沉法超声波辅助提取花椒叶多糖，基于单因素实验并利用响应面软件对花椒叶多糖提取工艺进行优化，得最佳工艺参数：料液比1∶20 g/mL、超声时间38 min、超声温度69 ℃、醇沉浓度90%，多糖的提取率为0.981%，高于齐素芬等[12]在花椒叶中测得的多糖提取率0.811%～0.889%。影响花椒叶多糖提取因素主次顺序是：醇沉浓度＞超声时间＞超声温度＞料液比。抑菌试验发现，花椒叶多糖对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏杆菌具有不同程度的抑制作用，且抑制作用随花椒叶多糖浓度的递增而逐渐增强。由此可见，花椒叶多糖可作为植物源防腐剂添加到包装熟食中，延长其保质期，提高食品的价值。 目录 1 实验部分 1.1 主要试剂与仪器 1.2 实验方法 1.2.1 花椒叶的前处理 新鲜完整花椒叶摘取后，用重蒸水冲洗其表面杂质，50℃下恒温干燥至恒重，粉碎并过60目筛，密封后储于阴凉处备用。 1.2.2 多糖提取工艺 取10.0 g干燥花椒叶粉末置于500 mL锥形瓶中，按一定料液比加入不同体积的重蒸水，使混合液在不同的浸提温度下于100W超声波中辅助浸提一段时间后，将浸取液减压浓缩后缓慢加入一定量的无水乙醇溶液，搅拌均匀后于4℃下静置4h，离心5min，收集沉淀物即为花椒叶粗多糖，干燥备用。 1.2.3 标准曲线的绘制 采用蒽酮-硫酸法[13]测定，准确称量0.0100 g干燥至恒重的半乳糖标准品，充分溶解后置于100 mL容量瓶中定容，摇匀，即得0.1 mg/mL半乳糖标准液；分别准确移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL半乳糖标准液于具塞试管中加纯化水至2.0 mL，再分别准确移取5.0 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，振荡后于70 ℃水浴20 min，降至常温后置于分光光度计中，在484 nm波长下[14]测其吸光值（A值）。 1.2.4 花椒叶多糖的测定及提取率计算 1.3 单因素实验 1.3.1 料液比对花椒叶多糖提取率的影响 取10.0 g干燥花椒叶粉末，在100 W超声波中，设定超声温度为60 ℃、超声时间为40 min、醇沉浓度为80%的条件下，料液比分别在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL的条件下进行浸提，研究不同料液比对花椒叶多糖提取率的影响。 1.3.2 超声温度对花椒叶多糖提取率的影响 取10.0 g干燥花椒叶粉末，在100 W超声波中，设定料液比为1:20 g/mL、超声时间为40 min、醇沉浓度为80%的条件下，超声温度分别在40、50、60、70、80 ℃的条件下进行浸提，研究不同超声温度对花椒叶多糖提取率的影响。 1.3.3 超声时间对花椒叶多糖提取率的影响 取10.0 g干燥花椒叶粉末，在100 W超声波中，设定料液比为1:20 g/mL、超声温度为60 ℃、醇沉浓度为80%的条件下，超声时间分别在30、40、50、60、70 min的条件下进行浸提，研究不同超声时间对花椒叶多糖提取率的影响。 1.3.4 醇沉浓度对提取率的影响 取10.0 g干燥花椒叶粉末，在100 W超声波中，设定料液比为1:20 g/mL、超声温度为60 ℃、超声时间为40 min，醇沉浓度(体积比)分别在55%、65%、75%、85%、95%的条件下进行浸提，研究不同醇沉浓度对花椒叶多糖提取率的影响。 1.4 响应面试验设计 在单因素实验的基础上，以超声时间(A)、超声温度(B)、醇沉浓度(C)为独立自变量，花椒叶多糖提取率(Y)为响应值，利用响应面中的Box-Behnken中心设计法进行提取工艺优化（表1）。 1.5 花椒叶多糖的抑菌试验 按牛津杯法进行抑菌活性测定[15,16]，以大肠埃希氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为受试菌，移取100μL菌液（浓度为107cfu/mL）均匀涂布于LB琼脂培养基平板上，浅浅插入6个已灭菌的牛津杯，并将200 µL不同浓度(0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL)的花椒叶多糖溶液加入牛津杯中，再把所有样液平板置于培养箱中37℃恒温培养18h，以无菌生理盐水为阴性对照，5%苯酚溶液为阳性对照[17]，观察抑菌效果，测量抑菌圈直径大小。 1.6 数据处理 每组实验都平行测定3次，取平均值，运用Microsof Excel 2010进行单因素和抑菌实验结果分析；利用 Design-Expert 10.0.4软件进行响应面法试验设计及数据处理。 2 结果与分析 2.1 单因素实验结果分析 2.1.1 料液比对花椒叶多糖提取率的影响 由图1可看出，随着料液比的不断增大花椒叶多糖提取率呈先快速上升达最大值后变化不明显。 2.1.2 超声温度对花椒叶多糖提取率的影响 由图2可看出，随着超声温度的升高花椒叶多糖提取率也持续增大，但当温度升至70 ℃时多糖提取率最大为0.903%，而后呈现下降趋势。 2.1.3 超声时间对花椒叶多糖提取率的影响 由图3可看出，在30～40 min之间，花椒叶多糖提取率随超声时间的增加不断增大；在超声时间40 min时，多糖提取率最大为0.911%。 2.1.4 醇沉浓度对花椒叶多糖提取率的影响 从图4可看出，醇沉浓度对花椒叶多糖提取率的影响，在55%～85%范围内，增加醇沉浓度可提高多糖提取率，但当沉淀多糖所用的乙醇浓度大于85%时，多糖提取率明显下降，这可能是由于醇沉浓度过大会导致沉淀过快而引入杂质[20]。 2.2 响应面实验结果分析 2.2.1 响应面优化试验设计和结果 2.2.2 回归模型的建立与方差分析 2.2.3 响应面分析 为了分析各因素对多糖提取率的交互影响，通过Design-Expert 10.0.4软件，输入试验结果可得到图5的响应曲面图，图5较为直观地显示了超声温度与超声时间、超声时间与醇沉浓度、超声温度与醇沉浓度两两因素间的交互作用。 2.2.4 工艺优化与验证试验 2.3 抑菌活性实验结果 植物多糖可影响细菌的细胞壁和细胞膜，增加其膜的通透性，削弱其膜的流动性，导致其细胞形态和结构发生不可逆的改变，进而起到抑制细菌生长和繁殖的效果[23, 24]。
引用本文：孙伟，蔡静，叶润，等. 响应面法优化花椒叶多糖提取工艺及抑菌活性研究[J].化学试剂, 2021, 43(1):109-114.
