新型冠状病毒核酸标准物质现状分析

杨雪^{a, b}，梁文^a，杨镇洲^a，徐勤^a，李妍^a，闻艳丽^a，刘刚^a，许丽^*a

（上海市计量测试技术研究院 a. 生物计量实验室，b. 上海市在线检测与控制技术重点实验室，上海  201203）

    新型冠状病毒肺炎是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的，其传染性高、致病性强，已在全球蔓延。核酸检测技术为新冠病人确诊和治疗提供科学依据，有效推动“早发现早治疗早隔离”的疫情防控策略。自新冠疫情爆发以来，我国陆续研制出来各种新型冠状病毒核酸检测试剂，为疫情防控提供了重要支撑，而新型冠状病毒核酸标准物质为核酸检测质量控制提供了有力保障。本文简单介绍了国内存在的3种不同形式的标准物质的原理和优缺点，列举了国内现有的新型冠状病毒核酸标准物质，对它们的研究现状及面临的挑战进行了阐述，并展望了未来的发展方向，为新冠病毒核酸标准物质的研制和使用提供了参考。

1  新型冠状病毒核酸检测方法

1.1  新型冠状病毒结构特征

新型冠状病毒为β属冠状病毒，有包膜结构，上面有3种蛋白：刺突糖蛋白（S，Spike Protein）、小包膜糖蛋白（E，Envelope Protein）和膜糖蛋白（M，Membrane Protein），颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140 nm。新型冠状病毒基因组为一条完整的单股正链RNA，至少包含6个开放阅读框。第一个开放阅读框约占整个基因组长度的三分之二，编码16个非结构蛋白，其余开放阅读框编码至少编码4个蛋白：刺突糖蛋白（S）、小包膜糖蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N，Nucleocapsid Protein）

1.2  新冠病毒核酸检测方法

新冠病毒核酸检测方法主要包括逆转录-荧光PCR法（RT-PCR）、环介导等温扩增法（LAMP）、数字PCR法和测序法等，RT-PCR和LAMP法检测SARS-CoV-2原理如下图所示。

a. RT-PCR法; b. LAMP法

RT-PCR法和LAMP法检测SARS-CoV-2原理图

2  新型冠状病毒核酸标准物质

标准物质具有复现、保存和传递量值的作用，是保证测量结果准确性与可溯源性的重要计量“器具”。新型冠状病毒核酸标准物质可以对新型冠状病毒核酸检测方法进行量值传递和对核酸试剂盒检测结果的准确度进行评价，为试剂盒检测结果的判定提供准绳。此外，还可用于新型冠状病毒核酸检测方法开发、检测试剂盒质量控制与评价，以及测量结果的量值溯源；参与新冠病毒核酸检测实验室的室内质控和室间质控，有效实现核酸检测的质量管理。

2.1  新型冠状病毒体外转录RNA标准物质

新型冠状病毒体外转录RNA标准物质是以DNA为模板在体外转录得到的RNA作为标准物质原料，并采用数字PCR等方法对相关基因进行定值得到相应的量值。体外转录的工作原理是以含有转录启动子的DNA（质粒、PCR产物、寡核苷酸片段）为模板，在转录体系的一系列转录因子的作用下，经RNA聚合酶合成RNA，体外转录过程见下图。

2.2  新型冠状病毒基因组RNA标准物质

新型冠状病毒基因组RNA标准物质是一种包含新冠病毒基因组全长RNA的标准物质，其研制过程如下：先从患者样本体内分离出新型冠状病毒，在宿主细胞或动物体内对病毒进行培养扩增，用物理或化学方式进行灭活，然后从灭活病毒中提取基因组RNA作为标准物质原料，最后采用数字PCR方法进行定值得到浓度量值。

2.3  新型冠状病毒假病毒标准物质

新型冠状病毒假病毒标准物质是将新型冠状病毒重要特征基因等构建至慢病毒或噬菌体等载体，转染细胞后经纯化获得的假病毒颗粒，经过核酸提取步骤之后，采用数字PCR进行定值。假病毒颗粒包含核酸及蛋白外壳，在结构上与天然病毒相似，对RNase A具有抗性，因此，可以稳定地保存和运输，并且可以参与整个核酸提取过程的质控。假病毒标准物质的制备过程见下图。

a. 基于慢病毒构建的假病毒; b. 基于噬菌体构建的假病毒

基于慢病毒构建的假病毒和基于噬菌体构建的假病毒示意图

3  国内外新型冠状病毒核酸标准物质现况

自新冠疫情发生以来，国内先后研制出4种新型冠状病毒体外转录RNA标准物质、2种新型冠状病毒基因组RNA标准物质以及9种新型冠状病毒假病毒标准物质，。不同种类的新型冠状病毒核酸标准物质各有优缺点，使用时应根据各自需求进行选择。

新型冠状病毒体外转录RNA标准物质优点是可用于新型冠状病毒检测方法的建立和验证、检测结果的量值溯源，还可以用于仪器的校准、测试、产品评价。缺点是：1）不参与新型冠状病毒提取过程的质控；2）由于转录技术的限制，体外转录RNA分子大小受限，仅能涵盖新型冠状病毒部分核酸序列，使用时需注意靶标位置。

新型冠状病毒基因组RNA标准物质则包含全基因组序列，适用于所有核酸检测试剂盒的评价。缺点是浓度较低、制备过程存在生物安全风险、原料成本较高且供应不稳定。

新型冠状病毒假病毒标准物质具有拟似病毒的物理结构和新冠病毒的特异性核酸序列，并且通过基因改造技术保障了其可靠的生物安全性、稳定性，可以最大限度地重现新冠病毒核酸检测过程，实现从病毒核酸提取到核酸检测的全过程的质量控制，为新冠病毒核酸诊断的结果提供精确的“生物标尺”。缺点是：1）浓度低、成本高；2）个别标准物质仅涵盖新型冠状病毒部分核酸序列，使用时同样需注意靶标位置。

4  标准物质应用

根据《核酸检测试剂盒溯源性技术规范》规定，进行核酸试剂盒质量评价应使用有证标准物质，当无相应的有证标准物质时可使用标准物质/标准样品、校准品或控制物质。新型冠状病毒核酸标准物质可有效确保RNA定量检测实现量值传递或者用于试剂盒性能评价，在临床检验、多家不同原理的病毒检测试剂盒生产企业、方法开发实验室等有着广泛应用。例如，李亮等用新型冠状病毒核酸标准物质候选物评价了6种试剂盒的检出限，并与试剂盒标称的检出限进行了比较，见图1。

图1 （A）使用标准物质候选物测量6种试剂盒的检出限并与标称的检出限进行比较；（B-G）对6种试剂盒进行概率回归分析

5  展望

为了进一步提升新型冠状病毒核酸检测的准确性、有效性和可比性，标准物质的研制工作必不可少。目前研制的新型冠状病毒核酸标准物质形式各异、各有优势：体外转录RNA以及基因组RNA形式的标准物质可以对逆转录过程和PCR扩增过程进行质控，但无法对病毒提取纯化等过程进行质控，应用范围有所限制。而假病毒形式的标准物质具有安全稳定、包含完整病毒结构的优势，适用于相关试剂盒的整体检测过程，但其制备过程较为繁琐、成本较高。新型冠状病毒核酸标准物质有助于提升新冠病毒检测的有效性，从而促进新冠病毒准确诊断和及时治疗。与此同时，标准物质也将帮助解决众多检测试剂盒量值溯源混乱的问题，为实现量值准确可比提供计量支撑。

新型冠状病毒核酸标准物质在提高核酸检测试剂盒一致性和准确性方面发挥了重要作用，但在其制备和使用中仍面临挑战，例如大多数核酸标准物质都不是全长序列，为了应对不断更新的核酸检测方法，应对新的变异病毒的出现，需要研发具有更好序列代表性、更广基因覆盖度的标准物质；研发具有更高质量水平的核酸标准物质，提升定值准确度，提升纯度、均匀性和稳定性等关键技术指标。