引用本文:张建花, 章志翔, 李蓄涵, 等. 基于银纳米颗粒免疫比色法检测甲胎蛋白[J]. 化学试剂，2023，45(10)：40-45.DOI:10.13822/j.cnki.hxsj.2023.0391
甲胎蛋白（AFP）是临床诊断肝细胞癌（HCC）最广泛使用的血清标志物，可用于HCC的诊断、治疗评估、预后预测和复发监测。传统的AFP蛋白的检测方法存在分析成本高、操作复杂等问题。因此，迫切需要开发一种简便、高效且成本低的方法用于癌蛋白检测。银纳米粒子具有较好的光学性能，制备成本低，可用于构建比色传感实现蛋白检测。基于银纳米粒子的比色法与传统的蛋白检测方法相比，具有操作简单、快速且具有较低的成本效益。
1.提出了一种银纳米粒子比色传感器可实现甲胎蛋白AFP的灵敏、高效检测;
2.操作简单，只需要将分析样本和免疫试剂相混合，发生免疫识别后即可检测;
3.与传统的ELISA和其他蛋白检测方法相比，本方法具有操作简单、快速且具有较低的成本效益，为癌蛋白的检测提供了一种新方案。1.1 主要仪器与试剂
1.2 实验方法
1.2.1 AgNPs的制备
种子银纳米颗粒的制备：将20 mL质量浓度 1%柠檬酸三钠溶液和75 mL超纯水加入至250 mL圆底烧瓶中，然后将混合液加热至70 °C，恒温反应15 min。由于AgNPs具有较大的消光系数，表现出尺寸依赖的光学特性，在生物传感领域展现出优异的性能。图2a TEM表征表明制备的银纳米颗粒的形貌为球形，粒径均匀，且具有较好的分散性，平均粒径为20 nm（图2b）。
a. TEM；b. 粒径分布；c. XRD；d. UV-vis
图2 AgNPs的表征
Fig.2 AgNPs characterization
2.3 AgNPs-抗体偶联物表征
为实现AFP特异性检测，需采用AFP特异性抗体对AgNP表面进行修饰。在制备AgNPs-抗体偶联物之前，首先采用SH-PEG-COOH对AgNPs表面进行功能化，以通过碳二亚酰胺法进行抗体与AgNPs的连接，并且修饰的PEG可以保持AgNPs胶体的稳定性，使其自身不发生团聚。图3a展示了AgNPs与抗体探针结合前后的UV-vis表征，可以看到经过层层修饰后，AgNPs的最大紫外吸收峰发生了红移；裸AgNPs的吸收峰为392 nm，经过PEG修饰后，移动至397 nm，继而连接完抗体（包被或标记）后，其紫外吸收峰位置移动至403 nm。
图中I-IV分别表示裸AgNPs，AgNPs-PEG，AgNPs-PEG-anti AFP(包被)偶联物，AgNPs-PEG-anti AFP(标记)偶联物
a. UV-vis；b. DLS
图3 AgNPs经PEG和抗体修饰前后的表征
Fig.3 Characterization of AgNPs before and after modification with PEG and antibody
2.4 免疫反应条件优化
免疫反应时间是影响免疫测定性能的重要参数，因此，我们研究了孵育时间对免疫复合物形成的影响。图4展示了AgNPs免疫复合物的粒径和孵育时间的关系。a.不同孵育时间下AgNPs免疫复合物的DLS图； b. AgNPs免疫复合物的粒径和孵育时间的关系
图4 AgNPs免疫复合物在不同免疫反应时间下的DLS表征
Fig.4 DLS characterization of AgNPs immune-complexes under different immune reaction time
本文采用三明治夹心结构，以AgNPs标记抗体作为检测探针，当体系中存在目标蛋白AFP时，抗原-抗体发生免疫识别，形成纳米颗粒团聚体，可通过银纳米颗粒溶液颜色的变化检测样品中目标蛋白含量。结果表明，随着AFP浓度的增大，AgNPs的颜色逐渐从黄色变为无色，并且其最大紫外吸收峰降低。本方法对AFP的检测限为7.4 ng/mL，并表现出较强的选择性。
