多光谱法结合分子模拟分析洛索洛芬和金属离子影响三磷酸腺苷对蛋白的作用机制
引用本文:刘里, 耿来应. 多光谱法结合分子模拟分析洛索洛芬和金属离子影响三磷酸腺苷对蛋白的作用机制[J]. 化学试剂, 2023,45(11)： 32-38.
DOI:10.13822/j.cnki.hxsj.2023.0404
药物与白蛋白的相互作用对药物的药理属性影响显著，因为只有未与白蛋白结合的药物分子才具有治疗活性。当两种或两种以上的药物同时进入体内时，它们可以在血浆白蛋白的同一部位结合。由于它们的竞争性结合，结合力更强的药物将取代结合力较弱的药物，从而增加了游离药物分子的数量。因此，对于含有多种活性药物成分的药物制剂设计来说，研究药物与血浆白蛋白之间的结合至关重要。本研究的主要目的是了解多药联合使用对血清白蛋白的影响；以期为洛索洛芬和三磷酸腺苷合并用药的适宜性提供一定的理论基础。
1.利用多光谱法结合分子对接模拟法探究在洛索洛芬和血浆中常见金属离子存在下，三磷酸腺苷与血清蛋白的作用机制，确定猝灭和结合常数、结合位点数、热力学参数、相互作用力类型、结合部位、药物协同作用类型和构象变化等；
2.不仅给后续进一步开展探究临床实践过程中应用联合用药对疾病进行治疗提供一定参考价值，而且为设计联合用药方案，实现提高临床疗效，降低药品毒性，延缓或避免抗药性的产生一定的启发。
1.2 实验方法
在10 mL容量瓶中依次加入1.0 mL（1.0 mol/L）NaCl、2.0 mL（0.05 mol/L）Tris-HCl缓冲溶液（pH 7.40）、1.0 mL（2.0 × 10-5 mol/L）SA、0.2 mL（3.549 × 10-3 mol/L）的洛索洛芬和不同体积的3.33 × 10-4 mol/L的三磷酸腺苷，用超纯水定容，分别在26.2、36.2、46.2 oC水浴锅内20 min后，通过多次扫描体系荧光光谱，找到最大激发波长在280 nm，在其最大激发波长下扫描体系的激发光谱，并记录最大发射波长下的数值（F）。上述容量瓶中未定容前，分别加入1 mL（1 × 10-2 mol/L）镁、钴、铁、锰和铬离子再定容，测定荧光光谱。按照上述方法配制溶液并扫描蛋白-洛索洛芬-三磷酸腺苷（SA-LOX-ATP）体系的紫外-可见吸收谱图。2.1 抑制荧光强度的类型
首先模拟实际血液环境，探究洛索洛芬、三磷酸腺苷和SA共存时荧光光谱的变化情况（见图1）。
固定CLOX和CSA浓度，改变CATP，以CATP为横坐标、F0/F为纵坐标作图，结果如图2所示。
根据线性方程的斜率和截距计算Kq等，结果列于表1。
2.2 表观结合常数和结合位点
使用研究药物与蛋白相互作用的lg[(F0-F)/F] = lgKb + nlgCATP公式[7-9]计算SA与LOX和ATP双药物分子相互作用的表观结合常数KB与结合位点数n。表2列出了其线性方程、相关系数以及由斜率和截距计算出的KB和n值。
2.3 作用力
利用热力学方程[10]和Ross等[11]总结出的判断规律推断出抑制反应的作用力类型。如表3所示，ΔG< 0且ΔH < 0，表明洛索洛芬和三磷酸腺苷与蛋白的反应为自发的放热反应。
2.4 结合部位的确定
依据单一药物和蛋白相互作用的常用的Sulkowska课题组[12-14]报道的方法研究洛索洛芬和三磷酸腺苷与SA结合部位。2.5 药物协同性
2.6 位域分析
2.7 金属离子的影响
2.8 分子对接分析本研究通过多光谱分析出在洛索洛芬存在条件下三磷酸腺苷对蛋白荧光产生静态猝灭，两者靠氢键和范德华力相互作用；洛索洛芬和三磷酸腺苷可以被蛋白运输；蛋白-洛索洛芬-三磷酸腺苷体系的结合位置位于SA的亚螺旋域ⅢA；洛索洛芬和三磷酸腺苷之间有弱的正协同效应；洛索洛芬和三磷酸腺苷对蛋白的构象产生一定的影响，结合位点离酪氨酸更近；详细研究了锰、铜、镉、镍和铁对双药物分子与蛋白结合的影响；分子对接结果佐证了光谱实验的结论。总之，此工作不仅给后续进一步开展探究临床实践过程中应用联合用药对疾病进行治疗提供一定参考价值，而且为设计联合用药方案，实现提高临床疗效，降低药品毒性，延缓或避免抗药性的产生一定的启发。
