2024.0498人血清淀粉样蛋白A纯品含量的同位素稀释质谱方法研究.pdf
背景介绍
文章亮点
1. 创新性建立基于氨基酸水解同位素稀释质谱法的血清淀粉样蛋白A绝对定量分析方法。
2. 基于三种氨基酸对血清淀粉样蛋白A定量并进行不确定度评定，方法的测定结果准确可靠，具有较高的精密度和准确度，样品中蛋白含量为(80.9±2.0) μg/g。
3. 建立的方法可溯源至SI单位，为血清淀粉样蛋白A的量值溯源提供一条完整的溯源链，为血清淀粉样蛋白A纯度标准物质的研制以及参考测量方法的建立奠定了基础。
内容介绍
1 实验部分
1.2 仪器分析条件
1.2.1 色谱条件
1.2.2 质谱条件
电离方式：电喷雾正离子模式（ESI+）；监测模式：多反应监测模式（MRM）；喷雾电压：1.0 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；脱溶剂气流速：900 L/h；锥孔气路流速：150 L/h。各氨基酸的定量离子对、锥孔电压、碰撞能量信息见表1。
1.3 标准溶液配制
1.4 蛋白质样品的水解
1.5 蛋白质含量计算
2 结果与讨论
重组人SAA蛋白经过MALDI-TOF MS分析测定其分子量，得到11678.73 Da单电荷母离子峰和5841.43 Da双电荷离子峰，结果如图3所示，与理论11682.7 Da分子量吻合。
2.3 质量指纹图谱分析
2.4 蛋白水解条件优化
分别考察水解温度90、110和130℃，水解时间2～88 h时，水解后3种氨基酸及其对应同位素内标的质谱峰峰面积比变化趋势，如图5所示。水解温度超过110℃，水解时间达到40 h后氨基酸及其内标的含量没有明显变化，说明SAA水解反应到达平台期，选择110℃和40 h作为最优水解条件。
2.5 线性范围、检出限和定量限
分别移取2、5、10、20、50、100、200、500 μL氨基酸混合标准溶液和100 μL氨基酸同位素内标混合标准溶液，混合配制得到8个不同浓度的标准系列工作液，其中氨基酸及其对应同位素内标的浓度比分别为0.02:1、0.05:1、0.1:1、0.2:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1，进行LC MS/MS分析。以氨基酸及其对应同位素内标的浓度比为横坐标，质谱峰面积比为纵坐标，作线性回归得到线性方程和相关系数，分别以3倍和10倍信噪比计算方法的检出限和定量限，结果见表2。
2.6 方法正确度验证
2.7 定量分析重组人SAA蛋白
3 测量结果的不确定度评价
3.2 SAA样品的质量、样品中加入氨基酸同位素内标的质量引入的不确定度
3.3 方法测量的重复性引入的不确定度
3.4 水解效率引入的不确定度
4 结论
青年编委介绍
刘刚个人简介
主要研究方向
生物计量生物传感
近五年代表作
1. Wang L L; Guo R Y ; Li L Y; Tao Q; Xu Q; Yang X; Liu X; Li J; Wang L H; Chang J X; Chang J X ; Wen Y L; Song S P; Liu G .Construction of an Enzyme Cascade Based on the Accurate Adjacent Arrangement of Coupled Enzymes Using a Triblock PolyA DNA Probe. JACS Au, 2023, 4(1): 228-236.
2. Li L Y ; Guo R Y ; Wang L L; Tao Q; Luo M; Ding M; Li Y; Yang L; Chen L Z;Yan J; Cao C M; Chang J X; Chen Y; Gong F Y; Wen Y L; Liu G. Development of a single-molecule nano-balance ratiometric electrochemical DNA biosensor using a triblock Poly-Adenine probe. Anal.Chem., 2023, 95(23):8816-8824.
3. Huo Y B; Yang J Q; Wen Y L; Liang W; Tao Q; Yan J; Xu H; Li L Y; Li Y; Xu L; Ding M; Gong F Y; Liu G. Lyophilized T Cell Reference Materials with Quantified Proportions of Subtypes. ACS Omega, 2024, 9(49):48452-48459.
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