2.1  双标记氨基酸同位素丰度计算

2.2  同位素丰度分析方法研究

以¹³C₂,¹⁵N-甘氨酸为例，分别对样品浓度，质谱扫描张数等可能影响同位素丰度检测结果的因素进行考察，确定同位素标记氨基酸样品的最佳检测条件；通过多次进样分析等对方法的准确性和稳定性进行考察。

2.2.1  LC-HRMS谱图分析

在正离子模式下对¹³C₂, ¹⁵N-甘氨酸进行液质联用分析，质谱图如图1所示，由于双标记化合物可能存在未完全标记的情况，因此在ESI⁺质谱图中可能存在[¹³C₂H₅¹⁵NO₂+H]⁺、[¹³CCH₅¹⁵NO₂+H]⁺ 、[¹³C₂H₅NO₂+H]⁺[¹³CCH₅NO₂+H]⁺、[C₂H₅¹⁵NO₂+H]⁺、[C₂H₅NO₂+H]⁺这6种分子离子峰，其精确质荷比可通过软件或原子精确质量计算。根据化合物的质谱图，结合同位素丰度的计算方法即可完成同位素丰度的计算。

2.2.2  峰面积/峰强度计算对比

2.2.3 样品浓度

如图2和表2所示，当¹³C₂, ¹⁵N -甘氨酸浓度为0.1 μg/mL时，计算得到的同位素丰度值为98.21%，相对标准偏差为0.28%，这可能是由于样品浓度较低时，含量较低的未完全标记化合物可能存在检测不到的情况，从而影响同位素丰度的准确计算；随着样品浓度增加，同位素丰度计算值也随之增加；当浓度增加至1 μg/mL时，同位素丰度计算值趋于稳定（99.03%），相对标准偏差小（0.01%），且与试剂标示值（同位素丰度：99 %）基本一致。因此后续实验选择样品浓度为1 μg/mL。

2.2.4  质谱图扫描张数

质谱图扫描张数对于丰度计算结果准确性也可能存在一定影响，对浓度为1 μg/mL 的¹³C₂, ¹⁵N-甘氨酸进行同位素丰度分析，分别取包含峰顶点在内的不同时间窗口，如图3中所标识窗口，质谱图叠加进行同位素丰度计算，结果见表3，不同时间窗口下同位素丰度计算值相对标准偏差为0.02%，平均丰度为99.08%，说明质谱图扫描张数对同位素丰度计算值的影响不大。

2.2.5  分子离子峰信号响应

各标记形式化合物的质谱峰强度与同位素丰度计算值的准确性密切相关，而质谱仪的质量歧视效应^[23]可能会导致某些标记形式化合物的分子离子峰强度降低或未检出，从而影响同位素丰度值计算。由于质量歧视效应客观存在且无法被消除，因此拟通过对¹³C₂,¹⁵N-甘氨酸天然同位素（即M+1，M+2）分子离子峰的理论峰强度占比和实测值的比较，间接考察了高分辨的质量歧视效应。如表4所示，理论同位素峰强度占比和实测值的偏差小于5%，间接说明质谱仪器的质量歧视效应较小，对于同位素丰度的计算影响较小^[24]。因此，在同位素丰度计算时可忽略质量歧视效应，直接利用公式进行丰度计算。

2.2.6  方法精密度

对浓度为1 μg/mL的¹³C₂,¹⁵N-甘氨酸重复进样6次进行同位素丰度计算考察方法的稳定性。结果如表5所示，计算得到¹³C丰度为98.88%，¹⁵N丰度为99.30%，相对标准偏差（RSD）均为0.06%，总同位素丰度为99.0%，RSD为0.05%，说明该方法精密度良好。

本文建立了基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度检测方法；通过考察样品浓度、扫描张数、信号响应等条件，对同位素丰度的分析方法进行了系统研究，结果表明该方法具有良好的准确性和稳定性，适用于双标记氨基酸的丰度测定。此外，该方法所需样品用量少，无需衍生化等前处理，操作简便，可同时得到多种同位素丰度，对于稳定同位素试剂质量控制、同位素示踪技术研究等应用具有一定的指导作用。