基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度测定方法研究
赵雅梦1,2,3 , 徐增益1,2, 范若宁1,2, 解龙1,2, 侯静华1, 李良君1, 刘建军3, 雷雯1,2
(1. 上海化工研究院有限公司,上海 200062;2. 上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台,上海 200062;3. 上海交通大学医学院附属仁济医院 核医学科,上海 200127)
背景介绍
随着生命科学领域的迅速发展,稳定同位素试剂尤其是同位素标记氨基酸在蛋白质组学、代谢组学等前沿科学研究中发挥着越来越重要的作用。除用于同位素试剂质量评价外,同位素分布及丰度作为重要参数在代谢流量分析等生物机制研究中起到了不可替代的作用。本文建立了一种基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度检测方法,具有良好的准确性和稳定性,所需样品用量少,操作简单,有望成为一种简便、通用的试剂质控方法;也将为同位素示踪技术应用研究提供数据支持。
文章亮点
1、以13C2,15N-甘氨酸(13C2H515NO2)为例,考察了样品浓度、质谱扫描次数等对同位素丰度测定的影响,建立了稳定、准确的同位素丰度计算方法,实现了13C和15N同位素丰度的同时测定;
2、将13C2,15N-甘氨酸应用于标记形式更为复杂的13C6,15N2-赖氨酸的同位素丰度计算,结果表明此方法具有较高的准确性和稳定性;
3、建立了一种操作简便、准确稳健的同位素丰度检测方法,可实现双标记氨基酸同位素丰度的快速检测。
内容介绍
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 标准溶液配制
1.3 实验条件
1.3.1 色谱条件
1.3.2 质谱条件
2 结果与讨论
2.1 双标记氨基酸同位素丰度计算
2.2 同位素丰度分析方法研究
以13C2,15N-甘氨酸为例,分别对样品浓度,质谱扫描张数等可能影响同位素丰度检测结果的因素进行考察,确定同位素标记氨基酸样品的最佳检测条件;通过多次进样分析等对方法的准确性和稳定性进行考察。
2.2.1 LC-HRMS谱图分析
在正离子模式下对13C2, 15N-甘氨酸进行液质联用分析,质谱图如图1所示,由于双标记化合物可能存在未完全标记的情况,因此在ESI+质谱图中可能存在[13C2H515NO2+H]+、[13CCH515NO2+H]+ 、[13C2H5NO2+H]+[13CCH5NO2+H]+、[C2H515NO2+H]+、[C2H5NO2+H]+这6种分子离子峰,其精确质荷比可通过软件或原子精确质量计算。根据化合物的质谱图,结合同位素丰度的计算方法即可完成同位素丰度的计算。
2.2.2 峰面积/峰强度计算对比
2.2.3 样品浓度
如图2和表2所示,当13C2, 15N -甘氨酸浓度为0.1 μg/mL时,计算得到的同位素丰度值为98.21%,相对标准偏差为0.28%,这可能是由于样品浓度较低时,含量较低的未完全标记化合物可能存在检测不到的情况,从而影响同位素丰度的准确计算;随着样品浓度增加,同位素丰度计算值也随之增加;当浓度增加至1 μg/mL时,同位素丰度计算值趋于稳定(99.03%),相对标准偏差小(0.01%),且与试剂标示值(同位素丰度:99 %)基本一致。因此后续实验选择样品浓度为1 μg/mL。
2.2.4 质谱图扫描张数
质谱图扫描张数对于丰度计算结果准确性也可能存在一定影响,对浓度为1 μg/mL 的13C2, 15N-甘氨酸进行同位素丰度分析,分别取包含峰顶点在内的不同时间窗口,如图3中所标识窗口,质谱图叠加进行同位素丰度计算,结果见表3,不同时间窗口下同位素丰度计算值相对标准偏差为0.02%,平均丰度为99.08%,说明质谱图扫描张数对同位素丰度计算值的影响不大。
2.2.5 分子离子峰信号响应
各标记形式化合物的质谱峰强度与同位素丰度计算值的准确性密切相关,而质谱仪的质量歧视效应[23]可能会导致某些标记形式化合物的分子离子峰强度降低或未检出,从而影响同位素丰度值计算。由于质量歧视效应客观存在且无法被消除,因此拟通过对13C2,15N-甘氨酸天然同位素(即M+1,M+2)分子离子峰的理论峰强度占比和实测值的比较,间接考察了高分辨的质量歧视效应。如表4所示,理论同位素峰强度占比和实测值的偏差小于5%,间接说明质谱仪器的质量歧视效应较小,对于同位素丰度的计算影响较小[24]。因此,在同位素丰度计算时可忽略质量歧视效应,直接利用公式进行丰度计算。
2.2.6 方法精密度
对浓度为1 μg/mL的13C2,15N-甘氨酸重复进样6次进行同位素丰度计算考察方法的稳定性。结果如表5所示,计算得到13C丰度为98.88%,15N丰度为99.30%,相对标准偏差(RSD)均为0.06%,总同位素丰度为99.0%,RSD为0.05%,说明该方法精密度良好。
3 方法应用
为考察方法的普适性,还对标记形式更为复杂的13C6,15N2-赖氨酸进行丰度计算。如表6所示,重复进样3次得到13C平均丰度为99.17%,15N平均丰度为99.31%,总同位素丰度为99.23%,与试剂同位素丰度标示值(同位素丰度值:>99.2%)基本一致,相对标准偏差<0.04%,进一步说明方法具有较高的准确性和稳定性,适用于双标记氨基酸的丰度计算,也将为双标记同位素试剂提供了一种新的质量控制方法。
4 结论
本文建立了基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度检测方法;通过考察样品浓度、扫描张数、信号响应等条件,对同位素丰度的分析方法进行了系统研究,结果表明该方法具有良好的准确性和稳定性,适用于双标记氨基酸的丰度测定。此外,该方法所需样品用量少,无需衍生化等前处理,操作简便,可同时得到多种同位素丰度,对于稳定同位素试剂质量控制、同位素示踪技术研究等应用具有一定的指导作用。
引用本文:赵雅梦,徐增益,范若宁,等. 基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度测定方法研究[J].化学试剂,2024,46(6):83-88.
DOI:10.13822/j.cnki.hxsj.2023.0664