多维度综合评价瞬时高温灭菌对丹参质量的影响
引用本文:庄新慧,焦连庆,于敏,等.多维度综合评价瞬时高温灭菌对丹参质量的影响[J] .化学试剂, 2024, 46(6):9-16.
DOI:10.13822/j.cnki.hxsj.2023.0803
2023.0803多维度综合评价瞬时高温灭菌对丹参质量的影响.pdf
背景介绍
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科植物丹参的干燥根茎，表面棕红色或暗棕红色，粗糙，具纵皱纹，主要成分为丹酚酸类、丹参酮类、多糖类及挥发油类等，在抗氧化、抗炎、抗肿瘤等方面具有良好活性。丹参在采收、加工、储藏等过程中容易污染微生物而影响药材质量，本研究采用瞬时高温灭菌技术对丹参进行处理，多维度综合评价了瞬时高温灭菌技术对丹参质量及安全性影响，为瞬时高温灭菌技术在丹参生产中的应用、质量控制及药效评价提供科学依据。
文章亮点
1.通过对不同批次丹参中多种化合物含量进行化学计量分析，明确影响丹参质量的重要标志物；
2.通过不同批次丹参抗氧化活性与化学成分间的谱效关系，确定丹参中抗氧化活性质量标志物，探索丹参抗氧化活性物质基础；
3.体外细胞毒性试验作为药物安全性评价的重要环节，用于初步评价瞬时高温灭菌过程中是否产生毒性物质从而对丹参药材的安全性造成影响。
内容介绍
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 实验方法
1.2.1 瞬时高温灭菌处理丹参样品
分别取10批丹参样品500 g，粉碎，过三号筛（50目），瞬时高温灭菌170 ℃处理10 s，工艺参数来源于本课题组前期优化工作，采用无菌均质袋分装，即得。
1.2.2 微生物限度检查
1.2.3 对照品溶液的制备
1.2.4 供试品溶液的制备
精密称取灭菌前和灭菌后丹参样品粉末各0.3 g，置25 mL 棕色量瓶中，加75%甲醇溶液稀释至刻度，超声处理30 min，静置，晾至室温，用75%甲醇补足减失重量，微孔滤膜滤过（0.22 μm），即得供试品溶液。
1.2.5 色谱条件
1.2.6 8种化合物含量测定
1.2.7 方法学考察
丹参中8种化合物的测定方法按照已发表的文献测定，文献已进行方法学考察，建立的指纹图谱的测定方法也与文献[12]方法相同。
1.2.8 质谱参数
2 结果与讨论
2.1 灭菌前后丹参微生物限度检查
灭菌前10批丹参需氧菌、霉菌和酵母菌均不可计，不符合药典规定的标准；瞬时高温灭菌后10批丹参样品各微生物总数见表1。
2.2 丹参8种化合物含量
2.3 DPPH•抗氧化活性测定结果
2.3.1 丹参样品及8种化合物单体DPPH•抗氧化活测定
参照陈仁强等[13]方法并加以改进，制成丹参药材质量浓度为0.6、0.36、0.3、0.18 mg/mL的75%甲醇溶液。在紫外波长517 nm下测定样品组溶液及样品对照组溶液、空白组溶液吸光度，每组样品设置3复孔，实验结果取平均值，样品对照组用样品溶剂替代DPPH•溶液，空白组样品溶液用无水乙醇替代样品溶液，结果见表3。
2.3.2 HPLC法筛选丹参8种化合物中DPPH•抗氧化成分
取浓度为12 mg/mL丹参供试品溶液与4 mg/mL DPPH溶液反应20 min，按1.2.5色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定。丹参样品反应20 min前后HPLC图见图1；根据峰面积变化计算反应率，结果见表4。
2.4 MTT法测定灭菌前后丹参样品HSC-T6细胞存活率
2.4.1 样品溶液制备
2.4.2 细胞存活率测定
灭菌前后细胞存活率均大于50%，灭菌前后的丹参样品溶液均无HSC-T6细胞毒性，结果见表5。
2.5 指纹图谱分析
选取15个峰作为共有峰，其中8个共有峰与丹参8种对照品图谱保留时间和最大紫外吸收波长相一致，见图2。
2.6 丹参15个共有峰成分鉴别及结构确认
用LC-MS法确认丹参样品中15个共有峰所对应的化学结构，结果见表6。质谱离子流图见图3。
2.7 统计与分析
3 结论
瞬时高温灭菌前后丹参微生物限度检查、8种化合物含量、DPPH•抗氧化活性检测、丹参指纹图谱相似度分析和HSC-T6细胞存活率分析结果显示瞬时高温灭菌对丹参质量及安全性无影响。紫草酸甲酯、丹酚酸B、丹参酸甲酯、丹参酮I、隐丹参酮、丹酚酸F、丹参酮IIA、二氢丹参酮I为丹参质量差异标志物；迷迭香酸、丹酚酸B、紫草酸、丹酚酸F为抗氧化活性的质量标志物。本研究为瞬时高温灭菌技术在丹参生产中的应用、质量控制及抗氧化活性物质基础的确定提供科学依据。
