2025.0007ROS响应型荧光传感器阵列构建及其鉴别肿瘤.pdf
背景介绍
癌症的早期诊断对其治疗以及预后评估均具有重要意义。目前基于抗体的检测方法已被临床广泛应用，但它们依然面临着一些问题，如肿瘤细胞标志物的缺乏和抗体本身的高成本。活性氧(ROS)是生物体内具有高反应活性的自由基。大量研究表明由于肿瘤细胞的异常代谢，肿瘤微环境通常呈现高氧化应激状态，其特点是升高的ROS可触发各种信号通路促进癌细胞的增殖。因此，异常的ROS水平已经成为肿瘤细胞的重要标志物之一。鉴于此，细胞内ROS的模式识别可成为癌症精准诊断的有效策略。
文章亮点
1. 仅通过调节pH值，作者成功合成了三种分别发射蓝色、绿色和黄色荧光的AuNCs@His，响应细胞内源性ROS后呈现不同程度的荧光淬灭响应，形成了独特的光学 “指纹图谱”。
2. 结合主成分分析，ROS响应型荧光传感器阵列被成功应用于区分肿瘤细胞类型，准确率达到100 %。此外，该传感器阵列在区分十二个临床乳腺癌样本的肿瘤细胞增殖状态方面也表现出优异的性能，这与Ki-67免疫组化检测结果保持一致。
内容介绍
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 试验方法
1.2.1 AuNCs@His的合成与表征
1.2.2 多类型ROS的制备
市售的H2O2 和NaClO 直接稀释，可分别制备H2O2和ClO-的工作液。FeCl2与H2O2 在酸性条件下通过芬顿反应得到·OH。NaNO2与H2O2 以1:5的物质的量比反应得到ONOO-。NaClO与H2O2混合搅拌得到1O2。将KO2溶解于DMSO中制备超氧自由基(O2·-)。
1.2.3 ROS响应的传感器阵列构建
1.2.4 细胞培养
1.2.5 体外细胞毒性试验
采用 MTT 法检测 AuNCs@His1、2和3的体外细胞毒性。简单地说，将 MDA-MB-231细胞接种于96孔微孔板中，培养24 h进行附着。之后，将含有3种不同浓度AuNCs@His的培养基分别 与MDA-MB-231细胞孵育24 h。然后，将20 μL(5 mg/mL)MTT试剂加入上述细胞中，再孵育4 h，然后用100 μL DMSO替换培养基，室温振荡10 min。最后，用酶标仪测定490 nm处甲瓒晶体的吸光度。细胞相对活力计算公式如下：细胞相对活力(%)= Abs(探针)/Abs(对照) × 100 %，其中Abs(探针)和 Abs(对照)分别为有探针和无探针时的吸光度[26]。
1.2.6 肿瘤细胞类型及增殖状态鉴别
1.2.7 患者队列
2 结果与讨论
2.1 多色金纳米团簇的制备与表征
2.2 ROS响应型传感器阵列的构建
接下来，以荧光猝灭效率为指标评估AuNCs@His 1、2和3对6种浓度相同的ROS (ClOO−、ONOO−、•OH、H2O2、1O2和O2•−)的荧光响应。如图2a所示，对应于不同的ROS，可以观察到一种独特的荧光响应模式。每个ROS的光学"指纹"可以通过具有颜色差异的热图直观地反映出来(图2b)。接下来，通过PCA对荧光响应模式进一步分类。如图2c所示，ROS的响应模式被很好地聚类成6个独立的组，没有重叠，表明荧光传感阵列可鉴别不同的ROS。定量传感函数是传感器阵列性能的另一个重要参数。以ClO−定量为例，如图2d所示，Au NCs @ His 1、2和3的荧光猝灭效率随着ClO−浓度的增加而增加，分别在0 ~ 200、0 ~ 600和0 ~ 100 μmol/L浓度范围内呈良好的线性关系。此外，热图清晰地显示了Au NCs @ His 1、2和3对不同浓度ClO−的不同荧光响应(图2e)。在PCA图中，不同浓度的ClO−( 1 ~ 120 μmol/L)可以被清晰区分，没有重叠(图2f)，证实了所提传感器阵列的浓度区分能力。
2.3 传感机制的探究
为了探究ROS响应型荧光传感器阵列的传感机理，采用XPS对AuNCs@His 3与ClO−反应前后进行表征。如图3a所示，AuNCs@His 3的XPS分析确定了Au 4f7/2和Au 4f5/2峰，结合能分别为84.4和88.2 eV，是对应于Au（0）和Au（I）两种不同组分的典型结合能。该结果清楚地说明了Au NCs @ His 3中Au（0）和Au（I）的共存，这可能有助于维持AuNCs@His 3的荧光稳定性[29]。计算得到AuNCs@His 3的Au（0）/Au（I）比率为1.24。然而，与ClO−反应后，Au（0）/Au（I）比值降低至0.39，表明Au（0）可以被ClO−有效地氧化为Au（I）（图3b）。同时，也探究了ClO−对表面配体的氧化作用。与未处理的AuNCs @His 3相比，ClO−处理的AuNCs@His 3的O—C＝O含量显著增加，而C＝N含量显著降低，这可能是由于L-组氨酸的咪唑环通过开环反应(图3c、3d)被氧化所致。
2.4 荧光探针的细胞摄取
2.5 肿瘤细胞的模式识别
3 结论
