背景介绍
叶黄素酯作为视觉健康的重要成分已被广泛应用，天然叶黄素酯主要来源于万寿菊，其花瓣中酯化叶黄素含量可达干重的20%以上。本文优化了一种新的提取叶黄素酯技术—超速破碎提取，最优提取工艺：提取转速为3500 r/min，提取次数为3次，提取时间为9 min，料液比为1:19（g/mL），得到叶黄素酯提取率为15.66 %。同时探究了叶黄素酯对Hela细胞生长影响，当叶黄素酯浓度为80 μg/mL时， HeLa细胞存活率降低近50%。为叶黄素酯的提取工艺和生理活性提供了技术支持和数据参考。
文章亮点
1.优化了超速破碎提取叶黄素酯的提取工艺，建立了一种新的提取叶黄素酯方法；
2.探究了叶黄素酯对Hela细胞生长影响，为叶黄素酯的抗癌活性提供了理论依据。
内容介绍
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 万寿菊提取物处理及叶黄素酯制备
精密称取8.000 g万寿菊粉末置于50 mL烧杯中，按料液比1:5、1:10、1:20、1:30、1:40 （g/mL）加入乙酸乙酯，在超速破碎提取法提取转速为3000 r/min下提取。抽滤，滤液倒入50 mL离心管中，6000 r/min离心3 min，将上清液移至圆底烧瓶，蒸除溶剂，加10 mL流动相溶解，过0.22 μm滤膜，待HPLC分析。通过制备色谱仪，从提取物中分离纯化出4种叶黄素酯。
1.3 4种叶黄素酯对照品标准曲线
1.4 色谱检测条件
采用Welchrom XB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm）分析色谱柱，流速为0.4 mL/min，波长为445 nm，在25℃检测，流动相为V（乙酸乙酯）：V（乙腈）：V（甲醇）=49：21：30，进样量为10μL，每个样品检测时间为90min，连续进样3次。采用Welchrom ultimate XB C18 （21.2 mm×250 mm，5 μm）制备色谱柱，流速为7 mL/min，波长为445 nm，流动相为V（乙酸乙酯）：V（乙腈）：V（甲醇）=49：21：30。
1.5 单因素实验
1.6 响应面实验
在单因素实验基础上，根据Box-Behnken-design实验设计原理[28]，选取提取次数（A）、提取时间（B）、液料比（C）为独立变量，以万寿菊中叶黄素酯收率（Y）为响应值，利用Design-Expert 13.0进行响应面实验模拟，优化超速破碎提取法提取叶黄素酯的工艺参数，表2为实验因素水平和编码表。
1.7 叶黄素酯收率计算
1.8 抗癌活性研究
1.8.1 细胞培养与分组
用RPMI-1640培养液体外培养人宫颈癌HeLa细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养，万寿菊提取液真空旋蒸，培养液溶解；根据万寿菊提取液中提取的4种叶黄素酯的浓度，将细胞分为20、40、80 μg/mL万寿菊提取物组，溶剂组作为对照组，不含细胞的培养基为空白组。
1.8.2 CCK-8实验
1.8.3 流式细胞实验
2 结果与讨论
2.1 单因素实验结果
2.1.1 提取次数对收率的影响
2.1.2 提取时间对收率的影响
2.1.3 料液比对收率的影响
2.1.4 提取转速对收率的影响
2.2 响应面实验结果分析
按照上述设计的响应面实验进行结果检测，把不同的提取次数（A）、提取时间（B）、液料比（C）的实验的收率（Y）列在表3中。应用Design-Expert 13.0软件对设计的3因素3水平的实验结果进行多项式拟合计算，响应面优化的分析结果和方差分析列在表4中。
2.3 验证实验
2.4 叶黄素酯对HeLa细胞存活率影响
与对照组（0 μg/mL）细胞存活率（96.67±1.53）%相比，浓度为20、40、80 μg/mL的叶黄素酯均可降低HeLa细胞存活率，其细胞存活率分别为（86.15±6.67）%；（70.82±6.75）%；（56.15±7.81）%，3组实验结果均具有统计学意义（P<0.05），如图4所示。
2.5 各组细胞凋亡率比较
3 结论 叶黄素作为食用添加和护眼产品主要成分广泛使用，但是容易被氧化而失去作用。而叶黄素酯化学性质稳定，直接用于护眼产品中能够避免叶黄素的氧化。本研究通过超速破碎提取法高效、常温地提取了万寿菊中叶黄素酯。优化了提取时间、料液比、提取次数等条件，采用Design-expert设计分析得到提取叶黄素酯最佳提取率为15.76 %时的工艺参数：提取3次，每次提取9 min和1:19（g/mL）的料液比。与实际实验结果相符。此外，发现从万寿菊提取物中提取出的叶黄素酯，不同浓度对HeLa细胞生长均具有抑制作用，随着浓度的增加，促凋亡作用增强。上述实验结果为叶黄素酯的规模化生产提供的技术支撑，也初步为叶黄素酯在抑制肿瘤细胞生长研究提供的数据参考。
通讯作者介绍
孙立权
个人简介
工学博士、副教授、硕士生导师，北京理工大学生命学院实验中心主任。参加过两项国家自然基金项目、一项国家863项目和一项国家科技支撑项目等，主持过两项学校基础研究基金项目。曾制备了一批抗生素药典相关物的标准品；开发了一种新型检测催泪剂的方法；扩展了正电子放射性药物自动合成装置的制备对象。担任中国仪器仪表学会药物质量分析与过程控制分会理事。
主要研究方向
农林废弃资源深度利用研究；天然生物活性物质的绿色制备和功能研究；生物分离分析方法的研究
近五年代表作
1. Axin Liang, Tianjian Lv, Bingchen Pan, Ziyu Zhu, Ruilin Haotian, Liquan Sun, Jiangjiang Zhang*, Aiqin Luo*.Dynamic simulation and experimental studies of molecularly imprinted label-free sensor for determination of milk quality marker [J]. Food Chemistry. 2024, 449,139238.（SCI收录，中科院一区）
2. Axin Liang, Weidong Zhao, Tianjian Lv, Ziyu Zhu, Ruilin Haotian, Jiangjiang Zhang, Bingteng Xie, Yue Yi, Zikai Hao, Liquan Sun, Aiqin Luo*. Advances in novel biosensors in biomedical applications [J]. Talanta. 2024, 280: 126709.（SCI收录，中科院一区）
3. Axin Liang, Huipeng Hou, Shanshan Tang, Liquan Sun, Aiqin Luo. An advanced molecularly imprinted electrochemical sensor for the highly sensitive and selective detection and determination of Human IgG [J]. Bioelectrochemistry. 2020, 137, 107671. （SCI收录，中科院一区）
4. 毛执鹏,孙立权,查凡,等.便携式水质生物毒性即时测定装备设计及研制[J]. 自动化与仪器仪表, 2024, (10):311-315.DOI:10.14016/j.cnki.1001-9227.2024.10.311.
5. 孙立权, 郜玉欣, 滕茂浩. 香紫苏醇发酵液中香紫苏醇的提取与纯化工艺[J]. 化学试剂, 2023, 45(12):48-53.DOI:10.13822/j.cnki.hxsj.2023.0251.
6.孙立权, 滕茂浩, 丛勇, 等. 响应面法优化柴胡药渣中柴胡皂苷提取工艺[J]. 北京理工 大学学报, 2023, 43(05):540-548.DOI:10.15918/j.tbit1001-0645.2022.106.
