2.1  仪器方法优化

对于恩诺沙星及磺胺嘧啶的液相色谱质谱分析多采用C18色谱柱^[11-14]，本研究比较XTerra C18、BEH C18及CSH C18色谱柱，XTerra能够实现恩诺沙星和磺胺嘧啶的分离，且两种化合物峰型较好，因此选用XTerra色谱柱。进行流动相条件优化，添加甲酸以提高恩诺沙星及磺胺嘧啶的离子化效率，进而提高响应和灵敏度，经优化，在水相中添加0.1%甲酸。优化后色谱分离见图1。

2.2  前处理方法优化

采用牛肉粉中恩诺沙星和磺胺嘧啶阳性样品进行提取方法优化，比较提取溶剂种类、提取次数、振荡时间、超声等条件的影响。

2.2.1  提取方法优化

乙腈和酸化乙腈在磺胺类药物和喹诺酮类药物的提取中应用较为广泛^[12-14]；三氯乙酸溶液由于具备较强的提取能力和沉淀蛋白的能力，在动物源食品中兽药的提取中也有较为广泛的应用^[14,15]。本研究比较不同提取溶剂，包括乙腈、1%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈、0.1 mol/L盐酸乙腈和5%三氯乙酸水溶液提取效率的差异（图2a）。

2.2.2  净化方法优化

固相萃取柱净化与正己烷除脂是畜禽肉中氟喹诺酮类药物和磺胺类药物净化常用的方法^{[14,18-20,21]}，本研究比较HLB、MCX和PAX这3种固相萃取柱对于恩诺沙星和磺胺嘧啶两种化合物的绝对回收率，结果表明，相比MCX和PAX固相萃取柱，HLB色谱柱，对于两种化合物都具备较好的绝对回收率（图2c），同位素内标校正后的加标回收率接近100%，因此，选用HLB固相萃取柱进行净化。

2.2.3 内标平衡时间优化

同位素内标与基体的充分混合能够保障同位素稀释质谱法（IDMS）的准确性。本研究考察了内标平衡时间0.5、2、10 h下结果的差异（图2d）。结果表明，平衡时间对恩诺沙星和磺胺嘧啶的回收率影响较小，因此，采用0.5 h平衡时间。

2.3  基质效应评价

在LC-MS/MS分析中，当目标物和基质共流出物竞争时，会发生离子抑制或离子增强效应，该现象被称为基质效应，基质效应的存在会影响定量的准确性^[22]。提取和净化方法、液相色谱条件等都会影响基质效应。柱后注射和前处理后添加的方法常被用于评价基质效应，其中，后者可以定量评价基质效应。本研究采用基体匹配校准溶液和校准溶液的响应之比来定量评价基质效应。基质效应（ME）因子的值大于1为基质增强，基质效应因子的值小于1为基质抑制。

2.4  定量方法比较

2.5  方法验证

以三倍信噪比的方法计算检出限，磺胺嘧啶的仪器检出限为0.002 ng/g，恩诺沙星为0.01 ng/g；牛肉粉中磺胺嘧啶的方法检出限为0.01 ng/g，牛肉粉中恩诺沙星方法检出限为0.05 ng/g。在0.05～50 ng/g范围内，添加2 ng/g同位素内标，进行恩诺沙星和磺胺嘧啶线性考察，得到的恩诺沙星标准曲线方程为y=1.0495x-0.0086（R²=1.0000），磺胺嘧啶标准曲线方程为y=0.9202x+0.0206（R²=0.9996）。

2.6  标准物质均匀性检验、稳定性检验与定值

2.6.1  均匀性检验

均匀性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质特性的空间分布特征。本研究根据JJF 1006《一级标准物质技术规范》和(JJF 1343《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》，对标准物质进行均匀性检验。采用简单随机抽样的方式，从标准物质的200个包装中抽取11个包装，每个包装取3个子样进行瓶间和瓶内均匀性检验。结果表明，F＜ F_0.05(10, 22)，标准物质均匀。

2.6.2  稳定性检验

稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性量值随时间变化的性质。本研究依据JJF 1006《一级标准物质技术规范》和JJF 1343《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》，进行短期和长期稳定性检验。

2.6.3  标准物质定值

2.7  标准物质不确定度评定

标准物质定值结果的不确定度由三部分组成，分别为：标准物质的均匀性引入的不确定度、标准物质的稳定性引入的不确定度、标准物质的定值过程带来的不确定度。

2.7.1  均匀性引入的不确定度u_bb

2.7.2  稳定性引入的不确定度u_s

2.7.3  定值过程引入的不确定度u_IDMS

2.7.4  不确定度合成