【热点文章】高效液相色谱法同时测定葵花盘粉提取物中的东莨菪素、芦丁、槲皮素和木樨草素
葵花盘粉富含黄酮等多种活性成分，具有降尿酸等药用价值，但目前尚无规范、统一的活性成分检测标准，产品质控手段不足。本研究选择东莨菪素、芦丁、槲皮素和木樨草素作为葵花盘粉产品中降尿酸成分的代表，通过优化样品前处理步骤和色谱分析条件，建立了葵花盘粉产品中4种成分的HPLC分析方法，为葵花盘粉类饮品的产品研发与质量控制提供了方法学参考。
1. 通过优化前处理方法的净化剂组成，以及色谱梯度洗脱程序，建立了快速测定葵花盘粉产品中4种成分的HPLC分析方法；
2. 不同产地来源葵花盘粉中的东莨菪素、芦丁的含量，均高于槲皮素、木樨草素，因而推测前两者对降尿酸效果所起到的作用更显著。
1.2 样品前处理步骤
以色谱甲醇为溶剂，配制了东莨菪素、芦丁、槲皮素和木樨草素的标准物质溶液，浓度均为400.00 mg/L，保存于4 ℃等待稀释使用。2.1 前处理条件的优化
根据植物组织中4种物质含量的特点，以及快速完成、简便操作的要求，选择QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe）方法作为样品的前处理方法。添加4种化合物标准物质到样品提取液中，添加含量均为5.00 mg/L，研究样品的净化剂组成。由于提取液本身含有4种物质，所以实际检测到的含量要高于添加含量值。选择PSA、C18、中性氧化铝和石墨化炭黑（GCB）作为候选净化剂，其中PSA、C18、中性氧化铝的候选用量均为每毫升提取液20、50和80 mg，GCB的候选用量为每毫升提取液5、10 mg，每组处理3个重复。样品涡旋混匀后，进行HPLC分析，以添加与未添加净化剂的峰面积之比作为回收率，从而选择合适的净化剂。结果如图2所示。
2.2 色谱检测条件的优化
4种物质标样分别进样后，通过DAD检测器得出4种化合物的紫外光谱图（图3a）。由图3可知，东莨菪素、芦丁、槲皮素和木樨草素在200~400 nm范围内有多个吸收峰，其中东莨菪素在228和344 nm处有明显的吸收峰，芦丁、槲皮素和木樨草素的两个较明显的吸收峰分别出现在257和356 nm、255和371 nm、254和350 nm处。
2.3 方法学验证
2.3.1 方法的工作曲线、检出限、定量限、精密度和重复性
配制了4种物质的混合标准溶液，系列浓度分别为0.08、0.10、0.15、0.25、0.50、1.00、5.00、20.00、50.00、75.00和100.00 mg/L, 采用优化后的仪器检测条件进样，以浓度x为自变量，以峰面积y为因变量，借助Graphpad Prism的线性回归模块得出4种化合物的线性回归方程及回归系数（R2）；对4种物质的标准溶液（1.00 mg/L）进行持续地稀释，得到不同浓度的标样稀释液，经仪器进样，得到4种物质峰信噪比（S/N）等于3和10时的对应浓度，作为分析方法的定量限（LOQ）和检出限（LOD）。
2.3.2 方法的添加回收率
将4种化合物标样分别添加至葵花盘粉样品，物质添加含量见表2，各添加含量的设置参考葵花盘样品的初始含量值，不少于初始含量值的5%。采用建立的前处理和仪器检测方法对样品进行测定，并计算4种化合物的添加回收率。
2.4 实际样品的测定
采用建立的HPLC分析方法，测定了一种葵花盘固体饮料产品以及两种产地的葵花盘粉样品，数据结果见表3。结果表明：东莨菪素、芦丁、槲皮素和木樨草素的含量范围分别为68.75~179.41 mg/kg、48.52~232.35 mg/kg、20.45~32.47 mg/kg和0.34~1.10 mg/kg。
通过优化QuEChERS前处理方法的提取液、净化剂组成，以及色谱流动相组成、梯度洗脱程序、检测器定量波长，建立了同时测定葵花盘粉样品中东莨菪素、芦丁、槲皮素和木樨草素的高效液相色谱分析方法。该方法定量限和检出限范围分别为0.08~0.15和0.02~0.06 mg/L；4种化合物的添加回收率范围为87%~97%，相对标准偏差范围为1.1%~5.2%。采用该方法对一种葵花盘粉固体饮品和来自两种产地的葵花盘粉样品进行了检测，测定结果显示：东莨菪素、芦丁、槲皮素和木樨草素的含量范围分别为68.75~179.41、48.52~232.35、20.45~32.47和0.34~1.10 mg/kg。葵花盘粉样品中东莨菪素、芦丁较高，该结果为葵花盘粉抗痛风的药效物质研究提供了重要参考。
