紫外分光光度法测定核酸含量的影响因素分析
李春1,刘建涛1,2,高运华*1,王治栋1,段学欣2
(1.中国计量科学研究院北京 100029;2.天津大学天津 300072)
摘要
选择寡聚核苷酸、鲑鱼精单链DNA、小牛胸腺双链DNA标准物质为样本,系统研究了溶液pH变化、苯酚、丙酮、蛋白质、多糖等对紫外分光光度法测量结果的影响情况,另外考察了核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的相互影响情况。研究发现基于分光光度法的核酸定量分析,易受溶液 pH、苯酚、丙酮、蛋白质、多糖等的影响,另外,DNA和RNA之间也会相互干扰。因此,紫外分光光度法测定核酸含量时,特别是方法用于核酸标准物质特性量值确定时,需要样品高度纯化,pH确定的条件下才能保证测量结果的准确可靠。
引言
随着微量分光光度计的广泛推广和应用,利用微量核酸样本定量核酸浓度成为了生命科学和临床检验等核酸相关研究实验室最常使用的方法[1-3]。紫外分光光度法简便快捷,在药物分析[4]、食品安全[5]、标准物质研制[6]等领域有着重要作用。紫外分光光度法测定核酸含量的分子基础是核苷为芳杂环化合物,结构中存在碱基、嘌呤和嘧啶中有碳碳、碳氮双键共轭体系,可以发生π→π*电子跃迁,从而产生紫外光谱[7, 8]。共轭体系的长度,环外双键的数目,共轭体系上取代基的种类、数目和立体结构等因素都对共轭多烯体系的紫外光谱有影响[9]。
核酸的紫外吸收值与核苷酸的组成和数量直接相关[10],数量达到一定的程度后,核酸分子中碱基间电子的相互作用使核酸分子具有吸收260 nm波长紫外光的特性,因此可以用260 nm的紫外吸收值定量核酸的浓度。
DNA的紫外吸收还与其结构有关,双螺旋结构存在时,部分碱基隐藏在内部,吸光度值减少。盐类阳离子可与DNA骨架磷酸基团结合使DNA收缩而产生减色效应,酸碱可与DNA碱基发生作用破坏DNA的双螺旋而产生增色效应[11, 12]。
另外,具有紫外吸收的其他化合物,如丙酮、苯系化合物、蛋白质等也是影响基于紫外吸收特性进行核酸定性和定量分析的重要因素。因此系统研究基于紫外吸收光谱性能的核酸定量分析影响因子,确定其影响程度,才能保障基于该方法的核酸定量分析结果的准确有效。本文从pH、有机溶剂、蛋白质、多糖等几个方面进行了系统的研究,为基于紫外吸收光谱的核酸定量分析提供了借鉴。特别是为基于该方法的核酸标准物质特性量值的确定,保障基于此方法的核酸标准物质特性量值的准确可靠提供了参考。
结论
基于紫外分光光度法的核酸定量分析,易受溶液pH、苯酚、丙酮、蛋白质、多糖等的影响,另外,DNA和RNA之间也会相互干扰。因此,紫外分光光度法测定核酸含量需要样品高度纯化,pH确定的条件下才能保证测量结果的准确可靠,否则测量结果仅具有相对参考意义。特别的,当使用该方法对核酸相关标准物质进行定值分析时,必需明确溶液pH值,并且要高度纯化,才可以使用该技术方法。
目录
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 实验设计
2 结果与讨论
2.1 寡聚核苷酸
2.1.1 pH值
2.1.2 有机物的影响
2.2 单链DNA和双链DNA
2.2.1 pH值的影响
2.2.2 有机小分子物质的影响
2.2.3 蛋白质的影响
2.2.4 多糖的影响
2.2.5 DNA和RNA相互间的影响
3 结论
引用本文: 李春,刘建涛,高运华,等. 紫外分光光度法测定核酸含量的影响因素分析. 化学试剂, 2020, 42(1): 53-57.
