低氧微环境普遍存在于实体瘤中，其氧浓度平均在1%～2%之间甚至更低。肿瘤低氧能够引起肿瘤细胞转移及抗凋亡能力的增强，并导致肿瘤细胞耐药性的增加^[1,2]。尽管肿瘤低氧是造成化疗效果降低的重要原因之一，但是，这同时也为低氧靶向抗癌药物的开发提供了作用靶点。因此，开发针对肿瘤低氧的药物筛选平台具有重要意义。传统的二维（2D）肿瘤培养操作简单、成本低，是目前体外药物筛选最常用的方法。然而，由于2D肿瘤培养不能模拟真实肿瘤组织中细胞间和细胞与细胞外基质的相互作用，不具备真实肿瘤组织中的微环境，不能充分体现复杂的生理三维环境，因此，往往导致抗癌药物敏感性在体外实验、动物实验和临床实验之间产生明显差异^[3]。

三维（3D）细胞培养模型是一种介于单层2D培养和动物实验之间的体外模型，不仅可以为体内实验提供更可靠的结果，并有助于提高后期临床试验的成功几率。目前应用较为广泛的三维培养模型主要有利用悬滴法、液体覆盖法和旋转法等建立的无支架培养模型，以及基于各种材料的支架培养模型^[4]。其中，3D培养支架可以为细胞的附着、生长、细胞间的相互作用以及细胞的增殖和迁移提供一个具有生物活性的微环境^[5]。用于3D培养的支架可由多种材料制成，包括生物材料和合成材料。其中，合成材料（如聚乙二醇、聚乳酸和苯乙烯）因其容易加工和高度可调的性质而被广泛应用于3D细胞模型的构建^[6-8]；而生物材料（如透明质酸、壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸盐和纤维素等）则因其具有良好的生物活性和生物兼容性，越来越多地被应用于3D细胞模型构建及药物活性评价的研究中^[9-12]。

壳聚糖是从甲壳类动物的壳中提取的一种天然阳离子聚合物，具有良好的生物兼容性、生物降解性和亲水性^[13,14]。透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）是一种天然的阴离子聚合物，存在于滑膜液、皮肤和软骨中，是脑组织细胞外基质的主要成分之一，具有良好的生物兼容性和吸水性，因此被广泛用于生物医学研究领域^[15]。此外，由于HA具有良好的延展性和保水性能，在细胞外基质的组装中发挥了重要作用^[15,16]。Wang等^[14]使用壳聚糖-透明质酸（Chitosan-HA, C-HA）支架在体外成功构建了胶质瘤U-87细胞的三维肿瘤球，并证明了该支架能够有效促进胶质瘤干细胞样细胞的增殖。与普通2D细胞相比，虽然已有研究表明使用C-HA支架建立的3D细胞对抗生素类和烷化剂类抗肿瘤药物均表现出更高的耐药性^[10,13]，然而该模型用于低氧靶向性抗癌药物的研究目前尚未见报道。因此，本研究利用壳聚糖和透明质酸制备了具有多孔结构的C-HA支架，并利用该支架构建了人脑胶质瘤SF763细胞的3D肿瘤球模型；在此基础上，研究了抗肿瘤药物尼莫司汀（Nimustine, ACNU）和替拉扎明（Tirapazamine, TPZ）在常氧和低氧条件下对2D和3D肿瘤细胞的抑制作用。

正文部分

1  实验部分

1.1  主要仪器与试剂

1.2  实验方法

1.2.1  壳聚糖-透明质酸支架的制备

1.2.2  壳聚糖-透明质酸支架的表征

1.2.3  3D细胞模型的建立及表征

使用人脑神经胶质瘤SF763细胞构建3D细胞模型。

1.2.4  低氧启动前药的抗肿瘤活性评价

将SF763细胞经胰酶消化制成单细胞悬液后，调整细胞密度至1×10⁶个/mL，取50 μL细胞悬液接种于24孔板中的C-HA支架中，于培养箱中孵育1 h后，每孔再添加1mL完全培养基；同时，在24孔板中每孔接种5×10⁴个细胞进行常规2D培养。

2  实验结果与讨论

2.1  C-HA支架的基本特征

如下图所示，壳聚糖是天然的阳离子聚合物，能够与阴离子聚合物透明质酸通过静电相互作用形成稳定的聚电解质复合物(PECs)^[19]。

2.2  3D细胞的形态表征

为了模拟体内肿瘤组织中的真实结构及肿瘤微环境，将人脑神经胶质瘤SF763细胞接种于C-HA支架72 h时后，得到的3D肿瘤球形态如图2a所示。从图2可以看出，2D培养中的细胞呈单层贴壁生长（见图2b），而3D培养中的细胞不仅可在三维支架中生长增殖，并且能够形成具有实体瘤结构的三维球体，该方法得到的3D肿瘤球平均直径大约为41 μm。

2.3  基于3D肿瘤球的药物活性测试

为了探讨3D肿瘤细胞对抗肿瘤药物耐药性和低氧选择性的影响，使用Alamar Blue法检测了在低氧和常氧下SF763细胞经ACNU和TPZ处理24 h后的细胞存活率。

3  结论