基于响应面法优化以ABTS为底物的漆酶测定方法及其应用
(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2. 金普海关，辽宁大连 116600；3. 哈尔滨海关技术中心，黑龙江哈尔滨 150028；4. 中国农业大学动物科学技术学院，北京 100083)
摘要
为探索一种最佳的漆酶酶活力测定反应体系条件，从而确定更为准确的酶活力测定方法，该研究以漆酶标品为研究对象，以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物，采用分光光度法确定漆酶标品稀释倍数与ΔOD值之间的线性关系以及最佳酶促反应时间，选取酶活力测定反应体系中的缓冲液浓度、pH值以及ABTS浓度作为影响因素进行单因素优化，以所测定漆酶酶活力为响应值进行响应面优化与评估。结果表明，漆酶标品稀释倍数在30～80之间与吸光度变化值线性关系良好，酶促反应中最佳酶活力测定时间为起始3min。反应体系中当醋酸-醋酸钠缓冲液浓度为50 mmol/L、pH4.0、底物ABTS浓度为1 mmol/L时，所测得漆酶标品酶活力最为接近真实值，为1040.49 U/g。将优化好的反应条件应用于生产漆酶微生物的酶活力检测中，从而确定菌株的产酶性能，结果表明，所优化的方法在测定微生物产酶活性方面十分稳定，具有可行性。
引言 漆酶(Laccase)是一种含铜的类多酚氧化酶[[i],[ii]]，能结合多个Cu2+，属于铜蓝氧化酶，其催化氧化反应机理是底物自由基的生成与漆酶分子中4个铜离子之间的协同作用[[iii]]。作为一种食用菌胞外酶系[[iv]]，漆酶在食品和生物技术等方面均具有一定的应用，是一类发现较早、研究较深远，且在生产实践中应用较广泛的酶类[[v],[vi]]。食品方面，漆酶可以提高其色泽度、风味及稳定性；工业方面，漆酶作为生物制剂可以用于医疗诊断中一些药物的合成[[vii]]。此外，一些微生物可通过产生漆酶来用于纸浆漂白、处理污水以及木质纤维素和有机污染物的降解[[viii]]等，既不污染环境又可以对可再生能源进行二次利用。 正文部分 1 实验部分 1.1 主要仪器与试剂 1.2 酶活力测定原理 1.3 酶活力单位及计算 酶活力单位（U）定义为每分钟氧化1 μmol底物或生成1 μmol产物的酶量。其计算公式如下所示。 1.4 试验方法 1.4.1 漆酶活力测定方法 30℃水浴条件下，反应体系包括1.8 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液、0.8 mL ABTS、0.4 mL酶液，紫外分光光度计测定反应3 min前后420nm处的吸光度值的增加，计算公式参照1.3。 1.4.2 漆酶标品稀释倍数的确定 将漆酶标品用醋酸-醋酸钠缓冲液进行稀释，分别取30、40、50、60、70、80稀释倍数下的漆酶溶液与ABTS进行催化反应，测定反应3 min后的OD420值，平行测3次，计算ΔOD420值，绘制稀释倍数-ΔOD值标准曲线。 1.4.3 反应时间的确定 为确定催化反应最佳时间，在反应时间分别为1、2、3、4、5、6min时测定反应溶液的OD420值，平行测3次，绘制时间与OD值变化曲线。 1.4.4 酶活力测定反应条件优化 在确定反应时间的基础上，选取催化反应中的缓冲液浓度、ABTS浓度、缓冲液pH值3个因素进行单因素优化。缓冲液浓度选取20、50、80、110 mmol/L，ABTS浓度选取0.5、1、1.5、2mmol/L，pH值选取2、3、4、5、6。 1.4.5 Box-Behnken设计与响应面优化 结合单因素实验结果，对缓冲液浓度（A）、ABTS浓度（B）、缓冲液pH值（C）3个因素进行3因素3水平的Box-Behnken设计，试验因素水平及编码如表1所示。 1.4.6 微生物产酶活性测定应用 将实验室分离筛选得到的具有木质素降解能力的菌株进行产酶发酵培养，发酵液4℃，8000 r/min离心10 min，取上清液作为粗酶液进行漆酶酶活力测定，从而评价反应条件的稳定性。测定方法按照1.4.1的方法。 2 结果与讨论 2.1 漆酶标品稀释倍数与ΔOD值的关系 2.2 漆酶催化ABTS的时间 2.3 单因素优化实验 2.3.1 缓冲液浓度对酶活力测定的影响 2.3.2 ABTS浓度对酶活力测定的影响 ABTS浓度对于酶活力测定结果的影响如图3b所示，底物浓度对于酶活力测定结果的影响十分明显，当ABTS浓度为1 mmol/L时，所测得酶活力值最优，之后随着浓度的增加而急剧下降。 2.3.3 pH值对酶活力测定的影响 2.4 Box-Behnken设计与响应面分析结果 2.4.1 模型建立及方差分析 根据Box-Behnken中心复合设计原理，以缓冲液浓度（A）、ABTS浓度（B）和pH值（C）为3个自变量，以漆酶酶活力（Y）为因变量设计了3因素3水平的响应面分析试验，具体试验方案如表2所示。 对二次模型进行方差和显著性分析，结果如表3。 2.4.2 响应面分析 2.4.3 验证试验 2.5 微生物应用 3 讨论 讨论 漆酶主要来源于细菌和真菌，因其在环境治理等方面应用价值较高[7]，研究者对其进行了大量的研究，包括其结构、酶学性质及催化反应机理等。随着漆酶在各个领域的广泛应用以及对产漆酶微生物的研究，酶活力检测成为了评价漆酶性能和微生物产酶能力的必用手段。在以ABTS为底物的酶活力测定过程中，不同参考文献中反应条件存在差异，这也说明确定一种准确、可靠的漆酶酶活力测定方法的重要性。本试验确定了漆酶标品稀释倍数与ΔOD值之间的线性关系以及酶活力测定的最佳时间，并对反应条件中影响酶活力测定结果的主要因素进行了3因素3水平的响应面优化。结果中，对于稀释倍数-ΔOD值标准曲线绘制以及反应时间的确定方面与张鹏等[[i]]的研究分析基本一致。在对缓冲液浓度和pH值以及ABTS浓度的响应面优化与分析[[ii],[iii]]中，ABTS浓度和缓冲液pH值均对试验结果有着显著的影响，而缓冲液浓度对试验结果影响则不显著，所确定的醋酸-醋酸钠缓冲液浓度和ABTS浓度与Xu等[[iv]]所采用的反应条件一致，pH值的选择有所不同。 响应面优化法是一种囊括试验设计和模型建立及验证的试验寻优方法，可以连续对试验的各个水平点进行分析，方法简便、应用广泛。我们在单因素预实验的基础上采用响应面分析法对3种主要因素进行优化分析，最终得到最佳反应条件为醋酸-醋酸钠缓冲液浓度50 mmol/L、pH值4、ABTS浓度1mmol/L。在此优化条件下所测定的漆酶标品酶活力最大程度的接近真实值，且测得的实际酶活力与预测值接近，说明该方法建立的模型能较好的对试验情况进行模拟且优化方法可行。除此之外，还将所优化的反应条件应用于微生物漆酶酶活力测定中，检验该条件在微生物产酶能力测定方面是否稳定。
引用本文：韩月颖，张喜庆，王琦，等.基于响应面法优化以ABTS为底物的漆酶测定方法及其应用[J].化学试剂, 2021, 43(8):1095-1101.
