内容介绍

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

1.2 实验步骤

1.2.1 灯盏乙素苷元的制备

1.2.2 二苯缩酮保护的灯盏乙素苷元的合成

在250mL的干燥洁净圆底烧瓶中，加入500mg(1.75mmol)灯盏乙素苷元，加入14mL二乙二醇二甲醚(DEME)将苷元溶解，加入251.6mg(1.75mmol)对二甲氨基吡啶(DMAP)，常温搅拌下缓慢滴加二氯二苯甲烷，滴毕，将体系升温回流反应2h。反应结束后，加入适量石油醚，待晶体析出完全后，去上清液，残余物经硅胶柱层析分离纯化，洗脱剂为V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1：70，得橘黄色粉末，产率为65%。

1.3 胆碱酯酶活性测试以及酶动力学测试

1.4 单胺氧化酶活性测试

1.5 化合物抑制/解聚Aβ_1-42聚集活性实验

1.6 透射电镜(TEM)观察Cu²⁺诱导的Aβ_1-42聚集/解聚

2 结果与讨论

2.1 酶活性测试结果

如表1所示，所有的目标化合物对eeAChE均显示了不同程度的抑制活性，IC₅₀值范围为3.50~12.69μmol/L，均优于阳性药，这表明N,N-双取代氨基甲酸酯的引入是抑制胆碱酯酶活性的关键。其中化合物4b、4c、6a抑制作用较好，有待进一步的研究。

2.2 酶动力学实验结果

基于上述结果，选择化合物6a进行eeAChE动力学研究，结果如图10a所示，eeAChE的Lineweaver-Burker图中所有的直线在第三象限中相交于一点，随着化合物(抑制剂)浓度的增加，斜率和截距都增加(即V_max减少，Km增加)，这一结果表明，化合物对eeAChE抑制机理为混合型抑制。以Lineweaver-Burker图中斜率对化合物浓度作图，如图10b所示，得抑制常数K_i值为3.61，表明化合物的抑制能力较强。

2.3 抑制/解聚Aβ_1-42聚集活性实验结果

2.4 透射电镜(TEM)观察Cu²⁺诱导的Aβ_1-42聚集/解聚

结果见图11，未孵育过的Aβ_1-42在电镜下呈比较规整分散的圆形颗粒，Aβ_1-42与Cu²⁺单独孵育24h后聚集成不规则的纤维状，Aβ_1-42与Cu²⁺单独孵育48h后聚集成不规则的纤维状较24h更明显。加入姜黄素和化合物6a后，聚集减少，且与化合物6a孵育的Aβ_1-42聚集程度比与姜黄素孵育的Aβ_1-42聚集程度明显减少。表明化合物能够有效抑制/解聚Cu²⁺诱导聚集，且抑制/解聚Cu²⁺诱导聚集的效果比姜黄素要好。透射电镜结果与硫磺素T法测得的结果一致。

3 结论

根据多靶点导向配体策略(MTDLs)，设计并合成9个双靶点抗阿尔兹海默症灯盏乙素苷元衍生物。结构通过¹HNMR、¹³CNMR、ESI-MS进行确证，9个终产物(化合物4a~4c、化合物5a~5c、化合物6a~6c)总产率范围在14.46%~19.37%之间。基于AD的胆碱酯酶假说和单胺氧化酶假说，根据Ellama法和Holt法，进行酶活性测试。结果表明，2-(4-((二甲基氨基甲酰基)氧基)苯基)-5,6-二羟基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯(6a)对两种酶表现出较好的抑制活性，对eeAChE的IC₅₀为(5.06±1.59)μmol/L，对MAO-B的IC₅₀为(23.61±0.27)μmol/L。化合物6a与eeAChE的酶动力学表明化合物6a对eeAChE是混合型抑制。

化合物6a不仅对自身和Cu²⁺诱导的Aβ_1-42聚集具有良好的抑制作用(87.57%和82.22%)，而且还能诱导自身和Cu²⁺诱导的Aβ_1-42原纤维的分解(75.01%和77.40%)。透射电镜实验证明了这一现象。实验表明，化合物6a可能是一个具有潜力的抗AD化合物，有待在抗氧化活性、金属离子配位、肝微粒体代谢等抗AD活性实验中进一步研究。