基于UPLC-Q-Orbitrap MS技术的沙棘黄酮类成分分析
引用本文:杨祖凡，王倩，赵晴，等. 基于UPLC-Q-Orbitrap MS技术分析沙棘果实中黄酮类成分[J]. 化学试剂，2024，46（2）：95-106.
DOI:10.13822/j.cnki.hxsj.2023.0726
背景介绍
沙棘作为药食同源的植物，其主要的功能性成分为黄酮类物质，具有多种药理活性。然而，目前对沙棘果中黄酮类物质的定性研究主要集中在基于在线数据库进行初步鉴定或仅对其中高含量的成分进行鉴定，缺乏基于LC-MS全成分视角的化学成分系统表征。天然药物发挥药效的物质基础不一定只是高含量的成分，其可能通过多靶点多成分联合作用而发挥其治疗作用，因此利用现代分析技术对沙棘果实中黄酮类物质进行系统剖析至关重要。
文章亮点
1.基于自建成分数据库的UPLC-Q-Orbitrap MS技术，快速全面地剖析了青海地区沙棘果中黄酮类物质的化学组成；
2.通过化学计量学分析方法比较了西北地区沙棘主产区的沙棘果黄酮类化合物的组分及差异变化；
3.为我国西北地区的沙棘黄酮类物质基础和资源利用研究奠定了基础。
内容介绍
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 实验方法
1.2.1 沙棘黄酮提取物的制备
沙棘干果在弃除坏果，剔除果柄后，粉碎过50目筛。按料液比1 : 25 (g/mL)加入80%乙醇浸提（含0.1%盐酸），温度45℃，超声重复提取2次。滤液于旋转蒸发仪45℃避光浓缩至无醇味。采用AB-8大孔树脂对以上浓缩样品进行纯化。将经大孔树脂纯化后的黄酮样品于45℃旋转蒸发50 min，再经-70℃预冻后冷冻干燥得到黄酮提取物粉末，置于-20℃冰箱中避光保存。
1.2.2 标准品溶液制备
分别取异荭草素、木犀草素、槲皮素、芦丁、儿茶素、山奈酚-3-O-芸香糖，表儿茶素和异鼠李素对照品适量，精密称定。精密吸取各对照品溶液1 mL，加入80%甲醇定容至刻度线，即得混合标准储备液，保存于4℃。
1.2.3 供试品溶液制备
1.2.4 LC-MS分析条件
1.2.5 化学成分数据库的建立
通过保留时间、误差在5 μg/ml以内的准确质量以及合理的裂解途径对候选化合物进行鉴定，并利用在线数据库Mzcloud进一步对鉴定出的成分进行二级碎片匹配鉴定，进一步补充和验证自建数据库搜索结果。
1.2.3 统计分析
利用多元统计分析方法，利用SIMCA 14.1软件对得到的数据进行主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。
2 结果与讨论
2.1 黄酮类化合物LC-MS鉴定
通过保留时间比对，精确分子量匹配和MS/MS碎片信息分析，共鉴定出58个黄酮类化合物。所有化合物的提取离子流色谱图（EIC）如图1所示。
2.2.1 黄酮及黄酮醇类化合物的质谱裂解规律
定性分析结果表明，沙棘果中主要的黄酮类物质为黄酮醇苷类，这些苷类的苷元主要为槲皮素、异鼠李素、山奈酚和杨梅素等。以异荭草素和槲皮素3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷为例对黄酮及黄酮醇类化合物的质谱裂解规律进行讨论，如图2 所示。
2.2.2 花色素类化合物的质谱裂解规律
花色苷具有黄酮类化合物特有的C6-C3-C6碳骨架结构，是由花色素（即花色苷的苷元）与不同的糖通过糖苷键缩合而成的一种黄酮类物质。化合物13、化合物17的二级质谱图如图3所示。
2.2.3 二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物的质谱裂解规律
二氢黄酮类为黄酮类C2-C3位的双键氢化后的衍生物，此类植物成分多数带有羟基或甲氧基，当C3位上带有羟基时，统称为二氢黄酮醇[39]。化合物38、化合物4的二级质谱图如图4所示。
2.2.4 其他黄酮类化合物的质谱裂解规律
沙棘果实中还鉴定出了查耳酮类和黄烷醇类化合物。化合物6、化合物34的二级质谱图如图5所示。
2.3 不同产地沙棘的比较分析
2.3.1 PCA和HCA分析
采用无监督的聚类分析方法（PCA）比较不同产地沙棘化学成分的异同（图6a），沙棘样本的层次聚类分析（HCA）如图6b所示。
2.3.2 差异黄酮类成分的筛选
2.3.3 差异积累的黄酮类化合物（DAFs）分析
在PCA和OPLS-DA多元统计分析的基础上，采用差异倍数（Fold change）和OPLS-DA模型的VIP值相结合的方法，结合之前鉴定的58种化学成分，筛选差异的黄酮类成分，如图7所示。
3 结论
本文通过系统性文献查阅，自建浆果黄酮类物质化学成分数据库，并联用UPLC-Q-Orbitrap-MS技术，建立了快速且全面地剖析沙棘果中黄酮类物质的方法。最终共鉴定出58种黄酮类化合物，包括34个黄酮醇类、4个黄酮类、14个花色素类、1个二氢黄酮类、2个二氢黄酮醇类，2个黄烷醇和1个二氢查耳酮，其中14个花色素类化合物为首次在沙棘果实中鉴定。相比于前人鉴定沙棘果中黄酮类化合物的局限性，本研究一定程度上丰富了沙棘果中黄酮类化合物鉴定的种类和数量。
此外，结合化学计量学分析方法（HCA、PCA和OPLS-DA）对不同产地的沙棘果实进行代谢轮廓分析，结果显示，各批样品可根据其产地来源进行聚类，并最终筛选出38种差异积累的黄酮类化合物，且大多数关键差异积累的黄酮类化合物在青海和西藏产地的积累量高于其他产地。
