引用本文:叶沛均，左成意，刘振虎，等. 治疗性单克隆抗体修饰变异体的液质联用分析技术进展[J]. 化学试剂，2024，46（12）:1-12.
治疗性单克隆抗体（mAbs）因具有靶向性高、药效作用强等优点而广泛应用于恶性肿瘤和自身免疫性疾病的高效治疗。由于抗体药物自身结构复杂，尤其在生产、储存等过程甚至在病人体内易出现各种修饰变化，如氧化、脱酰胺化、糖基化等，这些修饰不仅会增加mAbs的异质性，还会影响其稳定性和生物活性，因此监测mAbs体内外修饰变化情况，对于药物研发、生产及体内命运动态变化分析意义重大。液质联用技术（LC-MS）通过将液相色谱分离和质谱检测相结合已成为抗体质量研究和临床监测的重要分析手段。
1. 本文从抗体修饰变异体分析的意义与价值为切入点，系统总结了样本前处理过程尤其是在复杂生物样本体系中如何实现精准识别和高效富集的抗体捕获技术；
2. 详细介绍质谱分析技术包括现有质谱分析策略的优缺点、不同类型的液质联用技术（RPLC-MS、HILIC-MS、HIC-MS、IEX-MS）在分离和表征修饰变异体上的应用进展等。
治疗性mAbs分子量约150 kDa，目前临床上大多数抗体药物是IgG1型抗体[13]。IgG1主要由两条分子量约为50 kDa的相同重链、两条分子量约为25 kDa的相同轻链以及铰链区三部分组成具有特定空间结构的四肽链结构[14]，其中轻重链通过一对链间二硫键相连，两条重链之间通过含有两对链间二硫键的铰链区连接。根据氨基酸序列的变异程度可将单抗的轻重链划分为独特的可变区（V区）和保守的恒定区（C区）两种结构域，分别对应可变轻链VL、恒定轻链CL和可变重链VH、恒定重链CH1、CH2、CH3（图1）。
传统单抗生产纯化工艺如过滤法、蛋白沉淀法、离子交换层析法等利用蛋白质共有的物化特性实现简单的初步分离，其富集纯化往往不具有选择性。然而抗体药物体内分析的临床样本往往来自人体血清，面临血清复杂基质中内源性成分非特异性干扰的挑战，血清蛋白种类丰富，其中白蛋白和免疫球蛋白约占蛋白总重量的75%[33]，因此如何开发高效精准识别的富集纯化方法对后续mAbs体内准确的修饰分析至关重要。2.2 酶切策略
酶切是指大分子单抗的消化过程，目的是通过特异性的酶如免疫球蛋白G降解酶（IdeS）、木瓜蛋白酶（papain）、胰蛋白酶（trypsin）、赖氨酸C端内切酶（Lys-C）、糜蛋白酶（chymotrypsin）等在相应的氨基酸位点上切成亚基或肽段混合物（图5和表1）。
由于抗体发生修饰可能会不同程度地改变其疏水性、表面带电分布等理化性质，导致不同分离机制的色谱方法对各种修饰变异体的保留和分离产生显著差异（表2）[60]。
3.1.1 RPLC-MS
反相液相色谱因具有较高的分辨率和良好的MS兼容性（RPLC-MS）成为肽图分析中使用最广泛的方法。其主要原理是根据疏水性差异分离，疏水性越强的物质与RPLC非极性固定相作用越强，出峰越慢，因此抗体原形和修饰变异体产生的疏水性差异比如常见的有N末端谷氨酸环化形成疏水性增加的焦谷氨酸盐，甲硫氨酸侧链氧化生成极性相对更大的甲硫氨酸亚砜等使得二者在RPLC中实现一定的有效分离后进入质谱鉴定。3.1.2 HILIC-MS
亲水相互作用色谱（HILIC）对亲水性化合物有较高的保留能力和选择性，能够弥补RPLC难以保留极性及强极性化合物的不足，目前生物药物研究中HILIC与质谱联用大多用于糖肽分离和聚糖分析[65-67]。3.1.3 IEX-MS
离子交换色谱法（IEX）常用于定性和定量分析单抗修饰引起的电荷异质性，分为阳离子交换色谱法（CEX）和阴离子交换色谱法（AEX）两类。由于大多数单抗具有碱性等电点，阳离子交换色谱法最常用于分离单抗PTMs引起的电荷变异体[68]，比如天冬酰胺脱酰胺化、唾液酸聚糖、糖化等产生的酸性变异体，N末端环化、甲硫氨酸氧化、天冬氨酸异构化形成琥珀酰亚胺等产生的碱性变异体[69-72]。3.1.4 HIC-MS
与RPLC相似的是，HIC也是一种根据疏水性大小分离物质的色谱方法，与MS联用在表征单抗氧化、天冬氨酸异构化、游离巯基等各种改变疏水性PTMs也有较广泛的应用[75-77]；与RPLC不同的是HIC是在非变性条件下（生理pH、室温、避免使用有机试剂）通过改变流动相中的盐浓度改变蛋白表面疏水斑块与色谱柱固定相之间的盐调控疏水作用来实现分离[78-80]，非变性的HIC-MS联用可以使蛋白维持非共价相互作用的原有构象和生物活性，分离和表征其天然状态下的疏水变异体，主要缺点是HIC模式下使用的高浓度非挥发性盐与MS不兼容，影响分析。3.1.5 多维液质联用
单一分离机理的液相色谱分离的PTMs变异体类型有限，尤其是性质相似的、低丰度的物种容易共洗脱，难以分辨。3.2 其他新型质谱技术
上述基于不同分离模式下的LC-MS技术能够有效鉴定和定量大部分与单抗理化性质相关的各种PTMs变体，然而部分不稳定的PTMs如脱酰胺中间产物琥珀酰亚胺的监测、复杂的聚糖同分异构体以及PTMs造成的单抗构象稳定性变化等深度表征难以实现，因此氢氘交换质谱、离子淌度质谱、库伦质谱等新型质谱技术研究的出现有利于提供PTMs的多维度表征信息。治疗性单克隆抗体作为医药领域新兴发展的蛋白药物之一，其独特优越的作用机制和疗效使得它在传统的化药治疗中脱颖而出，成为广泛研发的热点。然而翻译后修饰产生的各种变异体是单抗内在异质性的主要原因之一，也是关键质量属性分析的重要内容，影响着药物的安全性和有效性，这些不确定因素需要严格监控，因此单抗药物的体内外修饰变化研究非常必要。与小分子不同的是，单抗具有分子量大、变异体多样、空间结构复杂等特点，对前处理和表征方法的要求更高，而质谱技术因其成熟的仪器发展和强大的结构解析能力，常与液相色谱联用用于单抗翻译后修饰的表征和定量分析。目前研究单抗修饰的发生机制及分析方法已经非常全面和成熟，通过构建体外监测模型有望预测体内外修饰的相关性，有利于药物研发初期的风险评估，为指导药物设计、评估其安全性和有效性提供依据。然而由于实际临床样本因获取来源有限、分析困难等，关于单抗体内生物转化研究仍不够深入，在未来如何选择合适的前处理和液质联用技术开发新型的方法策略构建抗体体内分析平台值得探索。
