热点文章 - 全国化学试剂信息中心.《化学试剂》期刊

《化学试剂》青年编委杨梦瑞等：基于水解氨基酸-同位素稀释质谱法的酪蛋白磷酸肽特征肽段纯度定值研究

2025-03-13 14:40

2024.0427基于水解氨基酸-同位素稀释质谱法的酪蛋白磷酸肽特征肽段纯度定值研究.pdf

背景介绍

生物界存在一些具有特殊生理功能的蛋白多肽，其在蛋白质体系中经适当酶解后，活性中心被激发，进而发挥出特殊的生理功能，一直以来这些生物活性肽的研究与应用是功能性食品添加剂和多肽类药物的开发重点，具有广阔的市场需求。酪蛋白磷酸肽（Casein phosphopeptides，CPPs）是含有成簇的磷酸丝氨酸的生物活性肽。由于CPPs组成复杂、检测难度较大、结果准确性不高。通过筛选酪蛋白磷酸肽特异性肽段（序列：YKVPQLEIVPNpSAEER)可以实现对混合多肽的定性和定量分析，为CPPs的产品质量控制、标准方法立项与未来有效实施、量值可溯源以及测量结果准确性与一致性等提供技术支撑。

文章亮点

1. 针对酪蛋白磷酸肽特征肽段YKVPQLEIVPNpSAEER，创新性建立基于水解氨基酸 - 同位素稀释质谱法（AA⁃LC - IDMS/MS）的纯度定值方法；

2. 不仅重点表征特征肽段原料结构信息，还优化肽段氨基酸水解条件，并讨论空间位阻对水解效率的影响；

3.运用建立的AA⁃LC - IDMS/MS方法，基于4种氨基酸对酪蛋白磷酸肽特征肽段原料定值，结果一致性良好，准确可靠，得出最终肽段定值结果为（0.916 ± 0.016）g/g ，为后续研究奠定基础。

内容介绍

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

1.2 实验方法

1.2.1 液相纯度分析

取1 mg酪蛋白磷酸肽特征肽段样品溶于 1 mL纯水，混匀后待测。

1.2.2 质谱定性分析

色谱条件：Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：25℃；流动相A：体积分数是0.1% 的甲酸水溶液，流动相B：乙腈溶液；流速：0.4 mL/min；进样体积：5 μL。梯度洗脱程序：0~5 min，2% B；5~15min，2%~98% B；15~17 min，98% B；17~17.1 min，98%~2% B；17.1~20 min，2% B。

1.2.3 定值分析

氨基酸综合标准液配制：将脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸样品精确称取至百万分之一的天平中，然后置于深褐色玻瓶内。注入0.1 mol/L盐酸水溶液，充分振荡深褐色玻瓶以完全溶解样品，制备出分别为0.1180、0.1200、0.0672和0.0672 mg/g浓度的混合标准液。

2 结果与讨论

2.1 液相纯度测定

通过高效液相色谱面积归一化法对CPP特征肽段原料纯度进行检测，结果如图1所示，CPP特征肽段液相纯度为99.24%，可以使用水解氨基酸同位素稀释质谱法对CPP特征肽段进行定值分析。

2.2 质谱定性分析

利用高分辨率质谱法对固相合成获得的CPP特征肽段样品进行定性分析。结果如图2所示，检测到质荷比m/z为1953.1、976.5和651.3这3个典型离子，分析可知m/z = 1953.1为YKVPQLEIVPNpSAEER的分子离子峰，m/z = 976.5和m/z = 651.3分别CPP特征肽段多电荷离子[M+2H]²⁺、[M+3H]³⁺。

2.3 前处理优化与LC-MS/MS方法测定

2.3.1 前处理优化

目前，氨基酸水解与同位素稀释质谱技术相结合是对蛋白质和多肽进行准确度定量的主要方法。氨基酸的种类众多，在定量中通常主要用到脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸等。根据文献[37]报道，蛋白质通常以6 mol/L盐酸水解为主，本研究采用相同浓度的盐酸，研究了0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL等不同用量对水解产率的影响，具体数据详见图4a。

2.3.2 LC-MS/MS方法优化

为了确保目标氨基酸能够做出良好的响应，对氨基酸和同位素标记的氨基酸质谱条件进行了优化。在对目标物进行电离模式的扫描时，观察到目标氨基酸在正离子模式下容易获得电子，从而形成稳定的准分子离子峰，因此，本次实验选择了正离子模式进行扫描。

2.4 方法学评价

2.4.1 线性考察

制备了浓度为10、25、40、50、70、90、120 mg/g的氨基酸标准溶液系列，并在每一种标准溶液中加入了50 mg的同位素内标。使用AA-LC-IDMS/MS方法进行了测定。根据测得的峰面积比（y）和质量浓度比（x）的数值，绘制出标准的曲线，并将其拟合成图6展示的曲线。研究结果揭示，所有氨基酸的线性相关系数都超过了0.999，这表明该测量方法适用于浓度在这一范围内的样本含量分析。

2.4.2 重复性和精密度评价

平行称量3份样品，充分水解后用LC - IDMS/MS法准确测定4种目标氨基酸，每份样品测3次取平均值为测定结果，再由氨基酸测定结果算特征肽段纯度。由表 1 可知，各测量结果的标准偏差不超过 2%，表明其精密度较为良好。

2.4.3 基质效应评价

本研究开展了基质效应考察，将空白水解液按照水解CPP特征肽段的方法进行水解模拟，实验结束后向其中添加与标准溶液相同浓度的氨基酸及其内标，按照优化后的LC-MS/MS方法上机检测，通过比较水解氮吹复溶后的氨基酸和标准溶液中离子峰面积，进而计算二者的比值，以此来考察样品的基质效应。如表2所示，各氨基酸及其同位素内标的ME值均接近等于1，说明基质效应影响可以忽略不计。

3 结论

本研究针对CPP 特征肽段 YKVPQLEIVPNpSAEER 进行了定值探究，着重对水解条件予以优化，实施了方法学考察，构建了基于4种氨基酸的水解氨基酸同位素稀释质谱法。基于4种不同氨基酸的肽段定值结果具有良好的一致性，定值准确且可靠，最终肽段的定值结果是（0.916 ±0.016）g/g。此外，这里的0.016仅考虑了重复性引入的分量。该方法的构建，为后续特征肽段标准物质的研制打下了基础。

上一篇： 【热点文章】4-苯氧基喹啉衍生...

下一篇： 【热点文章】澳洲檀香精油工艺提...