背景介绍
黄芪是山西十大道地药材之一，其主要活性成分为黄芪多糖（Astragalus Polysaccharide，APS），研究表明不同分子量黄芪多糖具有不同生物活性，目前低分子量（＜10 kDa）范围中300 Da、2、2.7、4.9、5.64、10 kDa分子量已得到均一多糖并进行结构分析，而3 kDa左右的均一APS未见报道。黄芪多糖作为疫苗佐剂可以增强免疫效果，提高抗体效价，且因结构明确、生物相容性好、易于化学修饰等特点，为其药物递送系统中的应用提供了可能。因此，本文通过超滤截留法和离子、凝胶色谱分离法制备3 kDa左右均一分子量黄芪多糖，并确认其结构特征，为进一步探究小分子量APS作为免疫增强制剂的构效关系及开发提供理论依据。
文章亮点
1. 首次成功分离出分子量约3 kDa的均一黄芪多糖APS-1a，填补了该分子量范围的结构研究空白；
2. 结构表征明确，其具有β-糖苷键连接的葡-半乳吡喃骨架，并含有O-乙酰基修饰，结构高度均一（PDI=1.18）；
3. 发现APS-1a在溶液中呈柔性无规线团，固态下可自组装为聚集体，为其在免疫调节与药物递送中的应用提供了结构基础。
内容介绍
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 实验方法
1.2.1 黄芪多糖的制备
将黄芪饮片粉碎，过40目筛，精密称取50.00 g黄芪粉末，置于1000 mL圆底烧瓶，加150 mL 75%无水乙醇，解吸40 min，按照料液比1:12（g/mL）加入80 ℃蒸馏水，80 ℃减压蒸馏6 min，抽滤，药渣同法提取2次，合并滤液，浓缩至250 mL，加无水乙醇至含醇量80%，静置过夜，抽滤，Sevage法除蛋白，大孔树脂除色素[12]，浓缩冻干，得黄芪多糖，精密称定其质量备用。
1.2.2 透析法分离3 kDa及以下黄芪多糖
1.2.3 DEAE-52离子纤维柱纯化APS-3k
1.2.4 Sephadex G-50凝胶柱纯化APS-1
称取25 g Sephadex G-50颗粒粉末，加入去离子水煮沸溶胀15min，冷却后超声除去气泡。湿法装柱后柱高225mm。用2～3倍柱体积的流动相平衡完成后备用[14]。
1.2.5 APS-1a的纯度、分子量、单糖组成测定
1.2.6 扫描电镜、红外光谱和核磁波谱分析
2 结果与讨论
2.1 APS透析结果
2.2 3 kDa及以下分子量APS柱层析纯化结果
使用DEAE-52离子交换柱纯化分子量在3 kDa及以下的黄芪多糖，根据流脱曲线（图1）结果，0~8瓶溶液合并，浓缩，冻干，得到淡黄色絮状产物（APS-1）。
2.3 APS-1a分子量检测结果
2.4 APS-1a单糖组成结果
APS-1a组分纯度较高，采用离子色谱法测定其单糖组成，单糖标准品和APS-1a的离子色谱图见图7、8，通过与单糖标准品图谱对比，根据出峰时间确定单糖种类，根据标准曲线结果（表3）结合峰面积确定各种单糖的物质的量比，APS-1a主要由葡糖糖和半乳糖组成，单糖组成物质的量比为n（gal）：n（glc）=4.49：95.71。结果表明，APS-1a为中性多糖，葡糖糖是APS-1a中的主要单糖。
2.5 APS-1a扫描电镜、红外光谱、核磁波谱分析
由电镜扫描图9显示，APS-1a多为表面粗糙的颗粒物或块状物，其中还存在链间氢键作用自组装形成的球状结构。在水溶液中，多糖分子被水合层包围，糖链运动自由，主要表现出动态的无规则线团构象[16]。当干燥脱水后，分子间作用力占据主导，同一多糖链的不同部分之间极易通过羟基发生分子间氢键结合，进而驱动其自组装形成颗粒状或球状超分子结构。这种“溶液柔性链”到“固态聚集体”的转变，为APS-1a在药物递送系统中的应用提供了可能。
3 结论
本研究经分离纯化首次得到一种分子量为3.38 kDa，以葡萄糖为主的均一黄芪多糖APS-1a，测定结果明确揭示，APS-1a具有以β-糖苷键连接的葡萄糖-半乳糖吡喃环骨架及特有的O-乙酰基修饰，且其高度的结构均一性（PDI=1.18）与明确的溶液构象为其功能研究奠定了基础。是否可以通过调控其乙酰化修饰或分子组装行为来定向增强其免疫调节活性，这为黄芪多糖的靶向制备与结构优化提供了新的研究方向。同时本实验为深入解析黄芪多糖的构效关系及开发其作为新型免疫调节试剂或先导化合物奠定了坚实的物质与理论基础。
