氯乙基亚硝基脲（CENUs）是临床上重要的抗癌烷化剂，广泛应用于脑瘤、淋巴瘤和黑色素瘤等恶性肿瘤的治疗。CENUs主要通过引起肿瘤细胞DNA互补碱基对鸟嘌呤和胞嘧啶之间的横向交联而发挥抗癌作用^[1-5]，然而在临床应用中，CENUs表现出的耐药性严重限制了该类药物的进一步应用与开发。因此，阐明耐药机制成为了新型高效低毒CENUs类药物开发中的关键问题。研究表明，O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)对DNA损伤的修复作用是导致肿瘤细胞对CENUs产生耐药性的主要原因^[6-9]。一系列研究证明，CENUs对AGT低表达的肿瘤细胞的抑制率显著高于AGT高表达的肿瘤细胞；而且AGT高表达能够明显抑制CENUs导致的肿瘤细胞DNA股间交联水平，这表明阻断AGT对DNA损伤的修复作用从而提高DNA交联率，可成为提高CENUs抗癌效果的重要途经之一^[10-14]。

有关AGT修复DNA损伤的研究表明，AGT蛋白可将鸟嘌呤O⁶位上的烷基转移到自身第145位半胱氨酸残基(Cys145)上，形成S-烷基半胱氨酸，从而使DNA分子中O⁶-烷基鸟嘌呤脱去烷基得以修复，AGT自身则不可逆的失活^[15]。AGT的这种修复作用对保护细胞免受烷化剂损害和防止细胞癌变具有重要作用，但同时也是导致CENUs等烷化剂类抗癌药物产生耐药性的主要原因。目前，AGT与DNA结合的晶体结构已有明确报道，Daniles等^[16]首次报道了AGT的晶体结构(PDB编号1T38)；在此基础上，一系列生物学实验证据表明AGT蛋白通过一个两步反应移除鸟嘌呤O⁶-位上的甲基：第一步是氢迁移，水分子将AGT活性中心Cys145巯基上的H原子迁移到第146位组氨酸(His146)上；第二步为甲基转移过程，第一步中形成的硫醇盐负离子对O⁶-甲基鸟嘌呤上的甲基进行亲核进攻，从而将甲基转移到Cys145上，使得鸟嘌呤得以修复^[15-17]。Georgieva等^[18]用密度泛函理论(DFT)方法研究了AGT修复O⁶-甲基鸟嘌呤(O⁶-MeG)的机理，结果表明氢质子通过Cys145-Water-His146-Glu172体系发生迁移，然后反应体系跨越甲基转移这一控速步骤。Shukla等^[19]也用DFT法研究了O⁶-MeG 的修复过程，研究结果也表明甲基转移的能垒高于氢迁移。Hou等^[20]进一步用量子力学和分子力学结合的法研究了O⁶-MeG 的修复机理，结果与Georgieva等的研究一致。

    在CENUs导致DNA 股间交联的过程中(如下图)，生成了两种重要的O⁶-烷基鸟嘌呤位中间体——O⁶-氯乙基鸟嘌呤(O⁶-ClEtG)和N1,O⁶-桥亚乙基鸟嘌呤(N1,O⁶-EtG)，AGT可对其进行修复，前者可与AGT反应形成氯乙基AGT，后者可与AGT反应形成AGT-DNA交联^[21,22]。目前，关于AGT修复CENUs导致DNA股间交联过程中生成的O⁶-烷基鸟嘌呤的作用机理尚未见报道。因此，本文对AGT修复O⁶-ClEtG和 N1,O⁶-EtG两种DNA交联前体物的反应机理进行了研究，比较二者修复的活性差异，找到修复过程中的关键步骤，并与交联形成的机理进行比较。

    本文使用DFT方法对AGT修复CENUs导致的两种GC交联前体物——O⁶-ClEtG和N1,O⁶-EtG的机理进行了研究，明确了修复反应中的控速步骤和优势途径；并使用分子对接方法获得了AGT与两种底物复合物的分子结构。结果表明，AGT修复O⁶-ClEtG的过程中第二步氯乙基转移为控速步骤，而修复N1,O⁶-EtG过程的控速步骤为第一步氢迁移反应。对比两种修复机理的势能图发现，AGT修复N1,O⁶-EtG需要跨越的能垒明显比修复O⁶-ClEtG的能垒低，而且前者生成修复产物的相对能量更低，这说明N1,O⁶-EtG的修复无论从动力学还是热力学上都有利于O⁶-ClEtG的修复。此外，O⁶-ClEtG和N1,O⁶-EtG都能够进一步反应形成GC交联，通过比较它们各自形成交联和被AGT修复的反应机理，我们发现O⁶-ClEtG更易于向生成GC交联的方向反应；而N1,O⁶-EtG则既可以与胞嘧啶反应生成GC交联，也可以被AGT修复形成AGT-DNA交联。本研究揭示了AGT阻断CENUs导致DNA股间交联的作用机理，为AGT介导肿瘤细胞对CENUs产生耐药性提供了合理的阐释；同时，也为二级损伤产物——AGT-DNA交联物的形成提供了理论依据。目前已有大量关于AGT抑制剂降低CENUs耐药性的研究，但是，过度抑制AGT的活性又可能导致正常细胞中AGT表达水平的降低，从而增加抗癌药物的毒副作用。因此，开发高效低毒的AGT抑制剂对提高亚硝基脲类药物的抗癌疗效具有重要意义。