引用本文:唐秀胜, 方镕泽, 吴红梅，等.白及多糖的提取、纯化技术及结构表征研究进展[J]. 化学试剂，2024，46（9）:41-52.
DOI:10.13822/j.cnki.hxsj.2024.0187.
中药白及Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f.为《中国药典》（2020版一部）收载品种，具有收敛止血、消肿生肌功效，临床上广泛用于各种出血、疮痈肿毒、皮肤皲裂等。白及多糖（Bletilla striata polysaccharide, BSP）是中药白及中主要有效成分。现代研究表明，BSP具有止血、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、黏膜保护和免疫调节等多种药理作用，同时在生物材料及医药领域被广泛应用。由于BSP具备优良的生物相容性、生物可降解性、结构易修饰性以及生物粘附性等特性，这使得其应用范围不断被拓展和深入，市场需求量不断上升。然而多数研究者只关注BSP的药理作用及临床应用，BSP的提取、分离、纯化及结构表征等研究还相对甚少，一定程度上限制了BSP的开发和应用。
1. 通过检索国内外近10年文献，以传统提取技术对比新型提取技术视角首先对BSP的提取进行归纳与总结，并分析各提取方法的优缺点；
2. 总结各提取方法、纯化方法及结构特征解析的特点；
3. 对BSP的提取、分离及结构表征的进一步研究提出展望。
不同的提取技术会影响BSP的得率，分子量和化学结构，选择合适的提取方式尤为重要[9]。当前BSP的提取方法主要有溶剂提取（Solvent Extraction，SE）、超声辅助提取（Ultrasonic-Assisted Extractio，UAE）、微波辅助提取（Microwave-Assisted Extraction，MAE）、红外辅助提取法（Infrared-Assisted Extraction，IAE）[10]，此外还有碱提取（Alkaline Extraction，AE）[11]、酶提取（Enzyme-Assisted Extraction，EAE）[12]，以及协同提取（Collaborative Extraction，CE）[13, 14]，各提取方法的优缺点比较见表1。
1.1 溶剂提取
SE技术主要是以水为溶剂提取BSP，其中采用浸渍、水煎煮、回流提取和连续提取较为常见，SE技术在实验室中被广泛使用，主要由于其设备需求简便，操作过程便捷，以及显著的成本效益。此外，SE技术还具有投资低、污染少和快速见成效的优点。1.2 超声辅助提取
UAE技术主要是基于空化、热力和机械效应，用于高效且迅速地从中药材中分离出有效成分。这种方法在提取BSP时表现出高效、快速、温和的显著优势，这有助于保持多糖的生物活性和结构的完整性。同时，UAE技术还能减少溶剂消耗，降低生产成本。通过调整超声波的频率、功率和提取时间等关键参数，可以精确调控提取过程，从而优化多糖的提取效率和纯度。1.3 微波辅助提取
MAE技术主要利用微波的穿透性、体加热、选择性加热和加速传质等特点，实现对中药有效成分的快速、高效、选择性提取。微波加热可以导致细胞内部压力增加，超过细胞壁的承受能力，从而导致细胞壁破裂，这有助于释放细胞内的活性成分，使其更容易被溶剂提取，一定程度上能增加中药有效成分的提取率。1.4 红外辅助提取
IAE提取技术是利用红外波长介于0.76~1000 μm，频率范围介于4×1014~3×1011 Hz的特性，通过吸收电磁波从而使物料内能增加，提高多糖提取效率[23]。在中药有效成分的提取过程中，红外是很好的加热源，还是理想的分子振动器，具有髙渗透性，且在操作上安全。1.5 碱提取
多糖是由多个单糖通过糖苷键连接而成的大分子化合物。在提取过程中，碱性溶液可以破坏植物细胞壁的结构，有助于多糖的释放，特别是对于那些含有糖醛酸等酸性基团的多糖，碱性条件有利于这些酸性多糖的浸出，因为碱可以中和酸性基团，减少多糖分子间的相互作用，从而促进多糖的溶解和提取[26]。1.6 酶提取
中药中的有效成分通常被植物细胞壁包裹，细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶质和木质素等构成，EAE技术是利用特定的生物酶（如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等）分解这些结构，从而破坏细胞壁，使得有效成分更容易释放到提取介质中[29]。同时，生物酶作为高效催化剂，能作用于植物细胞，增加细胞通透性，促进胞内物质渗漏。相关研究表明，酶辅助可以提高多糖的提取效率和生物活性[30]。1.7 协同提取
CE技术通常是指将两种或多种提取技术结合起来，利用各自的优势，通过相互作用提高中药有效成分的提取效率，协同提取过程中，可以通过优化提取条件（如温度、pH、时间、酶浓度等）来提高提取率，同时减少对热敏感成分的破坏。多糖（polysaccharides）又称多聚糖，由10个以上的单糖分子通过糖苷键聚合而成，其相对分子质量较大，多糖是一类大分子化合物并广泛存在于植物中[42]。多糖类化合物在提取分离过程中存在较多杂质，例如蛋白质、油脂及色素等，在临床应用及工业生产中常需要进一步分离纯化，通过纯化过程，可以获得具有特定疗效的均一多糖，便于质量控制和标准化，旨在提高其生物活性。BSP的纯化过程首先是除去杂质，其次是进一步分离纯化获得均一多糖，BSP的提取、纯化流程图见图2。
2.1 除蛋白质
在除蛋白过程中，由于蛋白质的分子量大、结构复杂，在除去蛋白质的过程中如何避免多糖的损失是当前研究的热点。BSP中除蛋白的方法常用Sevage法、蛋白酶法、三氯乙酸、絮凝剂等方法去除[13, 42]。2.2 脱色素
多糖在提取纯化过程中有大量的色素存在，除去色素是一个重要的步骤，有助于提高多糖的纯度。过氧化氢（H2O2）是一种常用的氧化剂，在植物多糖的纯化过程中，可用于脱除多糖中的色素。车向前等[48]采用L9（34）正交试验，以H2O2的体积分数、脱色温度、脱色时间、pH值为试验因素，考核指标为脱色素率和多糖保留率。2.3 分离纯化
为进一步研究BSP的单糖组成、平均分子量、糖苷键构型及特征，除去杂质后，还需要进一步分离纯化，获得均一BSP组分。BSP常用的分离纯化方法是分级醇沉法、膜分离法、阴离子交换色谱法及凝胶色谱法。分级醇沉法是一种用于提取和纯化多糖的常用技术。这种方法通过使用不同浓度的乙醇来沉淀多糖，从而实现对多糖的分级和纯化。在分级醇沉中，多糖溶液会按照预定的醇浓度逐步增加，每一步中较高浓度的醇会导致多糖的沉淀，然后通过离心等方法分离出沉淀物，最终得到不同纯度的多糖组分。研究中药中化学成分的结构表征对于揭示中药的药效物质基础，深化药性理论及推动新药研发等具有关键作用。BSP是一种从中药白及中提取的水溶性多糖，主要由葡萄糖和甘露糖通过β糖苷键形成的甘葡聚糖。对于其结构表征通常包括多糖纯度分析、相对分子质量测定、单糖组成关系分析、糖链结构的分析等。尽管BSP的结构解析已取得显著的研究进展，但BSP的高级结构及生物活性有待进一步探索，BSP的结构信息如表2所示。
3.1 BSP的纯度分析
多糖的纯度分析是研究其结构特征的重要环节，当前常用苯酚-硫酸法对多糖样品中总糖含量进行测定，紫外（UV）分析是否有残存的蛋白及核酸等杂质以及采用考马斯亮蓝法对多糖样品中蛋白含量进行测定，元素分析仪分析N元素和H元素含量，凯氏定氮法测定样品中的氮含量，间羟基联苯法对多糖样品中糖醛酸含量进行测定。研究表明，采取破壁榨碎辅助水提醇沉的方法提取白及粗多糖，通过Sevag法除蛋白、反复透析冻干等步骤进行分离纯化，苯酚-硫酸比色法显示其纯度均大于99 %[73]。3.2 BSP的相对分子量测定
相对分子质量是多糖重要物理特征之一，BSP相对分子量测定常采用高效液相色谱联用蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）、高效尺寸排除色谱联用多角度激光散射（HPSEC-MALLS）、凝胶渗透色谱法（HPGPC）、高效体积排阻色谱法（HPSEC）等来测定[13]。3.3 BSP的单糖组成
单糖是组成多糖大分子的基本单元，单糖组成分析是研究多糖的理化性质和结构解析的重要步骤。当前常用的分析方法有薄板层析法（TLC）、气相色谱法（GC）、毛细管电泳法（CE）、高效液相色谱法（HPLC）、离子色谱法（IC）气相色谱-质谱（GS-MS）。BSP主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖组成，其中葡萄糖、甘露糖最为常见。3.4 BSP的糖链结构
目前BSP的糖链结构主要是对单糖的类型、排列顺序以及单糖之间的连接方式进行一级结构研究。通过甲基化反应、Smith降解法、酸水解法和高碘酸氧化法等，确定BSP中单糖组成、糖苷键类型和比例、糖苷键位置以及支链多糖的分支数目。同时可采用红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）、气相色谱（GC）和质谱（MS）等物理分析方法，不仅适用于确定白及多糖糖苷键类型和构型，还能确认多糖链上的取代基类型。研究中药中有效化学成分的提取、分离及结构表征是当前推进中药现代化的重要措施，对于明确提取工艺流程，探讨药效物质基础，提高临床应用具有重要意义。鉴于BSP易溶于水的特性，当前的提取分离技术主要采用水提醇沉法，同时辅助使用超声波、微波、红外、生物酶及多方法协同提取，可以一定程度上缩短提取时间、降低提取温度、同时提高BSP的提取率。但受提取方式、物料颗粒的粉碎细度、料液比、提取时间、提取温度等因素的影响，各方法的提取率差异较大，高效提取和大规模应用难以有效结合。BSP的分离纯化研究方面，主要采用过氧化氢、活性炭、大孔树脂脱色素；采用Sevage法、蛋白酶法、三氯乙酸、絮凝剂等方法除蛋白；采用分级醇沉法、膜分离法、离子交换色谱法及凝胶色谱法进行分离纯化得到均一多糖。仍存在多糖损失增加、多糖得率减少或结构损坏等情况。在结构表征方面，主要是对BSP进行纯度分析、相对分子质量测定、单糖组成关系、糖链结构等一级结构特征分析。随着技术的发展，未来对BSP提取、分离、纯化及结构表征应聚焦在以下几个方面：1）当前常用的SE、UAE、MAE、IAE、AE、EAE、CE技术均有各自的优缺点。然而，UAE、MAE、IAE、AE、EAE、CE技术较SE技术提取效率高，今后可进一步结合离子液体、低共熔溶剂、超临界流体萃取及加速溶剂萃取方式研究BSP提取，开发更高效、更环保且不破坏多糖结构的提取方式；2）BSP的纯化技术可将Sevage法、大孔树脂、分级醇沉、膜分离与柱层析有效结合，提高分离纯化效果，以获得纯度较高的BSP；3）在得到BSP的单糖组成、相对分子量、糖苷键类型、糖苷键连接方式等一级结构相关信息后，以计算机与多种分析方法融合，应用X-射线衍射法（X-ray diffraction，XRD）获得BSP的空间排列信息，建BSP的分子和晶体结构模型；圆二色谱（circular dichroism，CD）分析BSP分子的构象变化及平衡结构；原子力光谱（Atomic force microscopy，AFM）在纳米尺度上进一步对BSP的高级结构进行解析，同时进一步明确BSP的结构-活性关系。拓展BSP在临床应用、生物医药及工业生产的使用。
